不同牧草來源飼糧對(duì)奶牛瘤胃液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

徐 俊 胡麗芳 侯玉潔 孫建勇 趙國(guó)琦

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，南昌 330200;2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009;3.新疆阿勒泰市第一牧場(chǎng)畜牧獸醫(yī)站，阿勒泰 836500)

反芻動(dòng)物瘤胃里面棲息著大量微生物，包括細(xì)菌、真菌和原蟲等［1］，纖維在瘤胃微生物作用下降解為揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體供能，而飼糧是影響瘤胃微生物組成和多樣性的關(guān)鍵因素［2－3］，研究不同飼糧組成對(duì)瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響，對(duì)進(jìn)一步研究瘤胃微生物對(duì)飼糧的降解和提高動(dòng)物生產(chǎn)性能具有十分重要的意義［4］。Thoetkiattikul等［5］利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了不同纖維和淀粉比例飼糧對(duì)奶牛瘤胃微生物特性的影響，發(fā)現(xiàn)瘤胃中主要的細(xì)菌包括擬桿菌門、硬壁菌門和變形菌門，且細(xì)菌豐富度與飼糧纖維含量密切相關(guān)。Tajima等［6］借助PCR技術(shù)和16S rDNA克隆文庫(kù)測(cè)序的方法研究了干奶牛飼糧由高粗料變?yōu)楦呔虾罅鑫敢褐械?(干草9kg，精料3kg)、3(干草 0.5 kg，精料 12 kg)和 28 天(干草 0.5 kg，精料12 kg)的微生物區(qū)系變化，發(fā)現(xiàn)2種飼糧中優(yōu)勢(shì)菌群都是革蘭氏陽性菌，且高精料飼糧中月形單胞菌屬、解琥珀酸菌屬和巨型球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。Mosoni等［7］發(fā)現(xiàn)高粗料飼糧條件下的優(yōu)勢(shì)菌屬為丁酸弧菌屬和普雷沃氏菌屬，其中鏈球菌、乳酸桿菌、反芻獸新月形單胞菌和嗜淀粉瘤胃桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。然而，前人研究多集中在飼糧精粗比和淀粉含量對(duì)瘤胃微生物的影響，很少考慮纖維來源和飼糧營(yíng)養(yǎng)組分對(duì)瘤胃微生物的影響。因此，本研究選用我國(guó)牧場(chǎng)常用的4種牧草(苜蓿、燕麥草、羊草和稻草)為粗料來源，以玉米青貯為基礎(chǔ)配制4組等能等氮且中性洗滌纖維(neutral detergernt fiber，NDF)和非纖維性碳水化合物(non-fiber carbohydrates，NFC)含量相同的飼糧，借助M iseq高通量測(cè)序技術(shù)研究不同牧草來源飼糧對(duì)泌乳奶牛瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、飼糧及設(shè)計(jì)

選用8頭體重為(632±12)kg，泌乳天數(shù)為(135±16)d的泌乳中期荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為4組，采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，每組2頭。分別以燕麥草、羊草、稻草和苜蓿為牧草來源，給奶牛飼喂以玉米青貯為基礎(chǔ)、等能等氮且NDF和NFC含量相同的4種飼糧;每期21 d，前14 d為預(yù)試期。以全混合日糧(TMR)形式，日喂 3次(06:30、14:30、22:30)。日擠奶 3 次(07:00、15:00、23:00)。單欄栓系式飼養(yǎng)，自由飲水。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.2 瘤胃液樣品采集與分析

每期試驗(yàn)的第19～20天通過口腔采集法采集晨飼后4 h(10:30)4組奶牛(每組各1頭)瘤胃液樣品50 m L［5］，采用糞便基因組提取試劑盒(QIAGEN公司)提取瘤胃液總DNA，提取方法參照試劑盒說明書。瘤胃液樣品分別編號(hào)為:燕麥草組(1、2、3 和 4)、羊草組(5、6、7 和 8)、稻草組(9、10、11 和 12)和苜蓿組(13、14、15 和 16)。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)的保守序列，設(shè)計(jì)通用引物 338F:5'－ACTCCTACGGGAGGCAGCAG－3'，533R:5'－TTACCGCGGCTGCTGGCAC－3'。PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 m in;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行21個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 m in;結(jié)束時(shí)4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后使用Axygen DNA膠回收純化試劑盒(Axy Prep DNA Gel Extration kit，APGX-500)對(duì)V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，經(jīng)Biotek酶標(biāo)儀對(duì)純化好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，將樣品等量混勻后形成均一混合物。PCR混合物經(jīng)質(zhì)量控制后，采用標(biāo)準(zhǔn)的Illum ina TruSeq DNA文庫(kù)制備流程構(gòu)建Illum ina測(cè)序文庫(kù)，最后按照Illum ina M iseq平臺(tái)上機(jī)進(jìn)行Barcoded Illum ina M iseq測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序結(jié)束后，對(duì)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制得到有效序列，再對(duì)有效序列進(jìn)行去雜處理，丟棄長(zhǎng)度短于120 bp、含有模糊堿基，引物堿基含2個(gè)以上的錯(cuò)配信息、單個(gè)堿基重復(fù)數(shù)超過6個(gè)的序列，最終獲得用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。通過Qiime分析平臺(tái)對(duì)優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)序列相似度為97%的原則，將序列歸為多個(gè)操作分類單元(operational taxonom ic unit，OTU)。然后對(duì)序列進(jìn)行聚類分析，選取每個(gè)類最長(zhǎng)序列為代表序列，采用RDP-classifier，以RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的序列為訓(xùn)練集，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行注釋，得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。通過軟件Mothur(http://www.mothur.org)對(duì)生成的 OTU信息進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析。應(yīng)用軟件Cluster 3.0將所有樣品在屬水平上的分類信息進(jìn)行聚類后作出Heatmap，同時(shí)對(duì)微生物群落進(jìn)行UniFrac分析，從遺傳距離上判斷不同樣本之間的距離遠(yuǎn)近，比較不同樣品間的差異性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理，結(jié)果采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件的PDIFF模塊進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，以 P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌豐富度和多樣性

通過Illum ina M iseq高通量測(cè)序后，本研究16個(gè)樣品共產(chǎn)生有效序列824 422條，經(jīng)質(zhì)量控制后得到800 261條高質(zhì)量序列，每個(gè)樣品平均產(chǎn)生50 016條序列，序列平均長(zhǎng)度為145 bp。由表2可知，苜蓿組和稻草組有效序列和優(yōu)質(zhì)序列數(shù)均顯著高于燕麥草組和羊草組(P＜0.05)。物種豐富度指數(shù)Chao指數(shù)的范圍為6 125～7 847，且苜蓿＞稻草＞燕麥草＞羊草;Ace指數(shù)的范圍為8 026～10 169，且苜蓿＞稻草＞羊草＞燕麥草，苜蓿組和稻草組均顯著高于燕麥草組和羊草組(P＜0.05)。物種多樣性指數(shù)Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)組間無顯著差異(P＞0.05)，這說明牧草來源對(duì)奶牛瘤胃液中的細(xì)菌多樣性無顯著影響。各牧草組文庫(kù)覆蓋率均在94%以上，這表明每個(gè)樣品的測(cè)序量合理，能較好反映各組瘤胃液中細(xì)菌群落種類和結(jié)構(gòu)的多樣性。

2.2 細(xì)菌組成和群落結(jié)構(gòu)

本試驗(yàn)采用RDP和Blast同源性序列對(duì)所有樣品進(jìn)行比對(duì)，共鑒定得到16個(gè)門，28個(gè)綱，42個(gè)目，64個(gè)科和89個(gè)屬。在門水平上，各組中擬桿菌門、硬壁菌門、螺旋體門和纖維桿菌門均為優(yōu)勢(shì)菌門，尤其是擬桿菌門和硬壁菌門分別占序列總數(shù)的 39.37% ～45.62%和 22.53% ～25.16%。而變形菌門、TM 7、無壁菌門、疣微菌門、酸桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門序列含量都較低。

由表3可知，在門水平下，相對(duì)含量大于0.1%的門共有10個(gè)，試驗(yàn)得出的其余6個(gè)相對(duì)含量均低于0.1%，豐度很低。此外，各組中還有1%左右(0.93%～1.23%)的序列無法進(jìn)行歸類。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明:稻草組和苜蓿組中的擬桿菌門分別占測(cè)序總量的45.62%和44.37%，顯著高于燕麥草組和羊草組(P＜0.05)，且燕麥草組最低(39.37%)，然而硬壁菌門則是燕麥草組最高，占測(cè)序總量的25.16%，顯著高于其他 3 組(P＜0.05)。羊草組中纖維桿菌門、變形菌門和疣微菌門相對(duì)含量極顯著高于其他3組(P＜0.01)。燕麥草組中的酸桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門相對(duì)含量極顯著高于羊草組、稻草組和苜蓿組(P＜0.01)。各組中的TM 7相對(duì)含量無顯著差異(P＞0.05)。

表2 97%相似性水平下物種豐富度和多樣性指數(shù)Table 2 Richiness and diversity index of species at 97%sim ilarity level

表3 相對(duì)含量大于0.1%(序列占測(cè)序總量比例)的菌門Table 3 Bacterial phyla w ith relative aboundunce above 0.1%(sequence percentage of total sequence amount) %

由表4可知，在屬水平上，序列比對(duì)得到的89個(gè)屬中共有13個(gè)菌屬相對(duì)含量大于0.1%，瘤胃液中有很多相對(duì)豐度較低的菌屬。在相對(duì)含量大于0.1%的菌屬中，各組中均以普雷沃氏菌屬、丁酸弧菌屬、纖維桿菌屬和密螺旋體屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，且普雷沃氏菌屬占測(cè)序總量的 19.10%(16.88%～22.84%)。各組間密螺旋體屬、厭氧原體屬、糞球菌屬、毛螺旋菌屬和新月形單胞菌屬相對(duì)含量無顯著差異(P＞0.05)。稻草組普雷沃氏菌屬極顯著高于燕麥草組和羊草組(P＜0.01)，羊草組中纖維桿菌屬極顯著高于其他3組(P＜0.01)。燕麥草組和羊草組丁酸弧菌屬顯著高于稻草組和苜蓿組(P＜0.05)，羊草組瘤胃球菌屬顯著高于其他3組(P＜0.05)，羊草組琥珀酸弧菌屬顯著高于燕麥草組和苜蓿組(P＜0.05)。

表4 相對(duì)含量大于0.1%(序列占測(cè)序總量比例)的菌屬Table 4 Bacterial genus w ith relative aboundunce above 0.1%(sequence percentage of total sequence amount) %

2.3 組間的相似性分析

將屬水平分類信息聚類后得到Heatmap，16個(gè)樣品分成2大簇，左邊第1大簇7個(gè)樣品(樣品1、5、6、7、8、13 和 15)，右邊第 2 大簇 9 個(gè)樣品(樣品2、3、4、9、10、11、12、14 和 16)，同一組樣品如羊草(5、6、7、8)和稻草(9、10、11、12)可以很好地聚在一起，但不同組樣品之間存在交叉現(xiàn)象(圖1)。

基于UniFrac的加權(quán)主坐標(biāo)分析其第1主成分和第 2主成分的貢獻(xiàn)率分別為 37.46%和28.73%，除羊草組4個(gè)樣品可以較好地和其他3組分開外，燕麥草組、稻草組和苜蓿組的遺傳距離更接近(圖2)，該結(jié)果與Heatmap的結(jié)果相吻合。

我們利用瘤胃液細(xì)菌群落中共享和獨(dú)自擁有的OTU的細(xì)菌豐度對(duì)4個(gè)不同組進(jìn)行分析，在97%相似性水平下，4個(gè)組共產(chǎn)生9 329個(gè)OTU(圖3)，其中燕麥草組、羊草組、稻草組和苜蓿組中 OTU 數(shù)目分別為6 710、6 522、8 032 和8 212，4組共享4 120個(gè)OTU，占瘤胃液細(xì)菌總OTU數(shù)目的44.16%，各組獨(dú)有的 OTU數(shù)目?jī)H占 0.39%、0.37%、1.11%和 1.49%。

3 討論

飼糧組成會(huì)影響瘤胃微生物區(qū)系，本研究發(fā)現(xiàn)稻草組和苜蓿組OTU數(shù)目高于燕麥草組和羊草組，在97%相似性水平下豐富度指數(shù)Chao指數(shù)和Ace指數(shù)顯著高于燕麥草組和羊草組，這可能與它們優(yōu)質(zhì)序列數(shù)高有關(guān)，該結(jié)果與通過16S rRNA基因雙末端焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究不同纖維/淀粉飼糧對(duì)奶牛瘤胃微生物豐富度的結(jié)論相一致［5］，給奶牛飼喂?fàn)I養(yǎng)組分均衡的飼糧瘤胃微生物多樣性比高纖維組或高淀粉組更好，然而，本試驗(yàn)各組飼糧營(yíng)養(yǎng)組分相當(dāng)，這可能是造成多樣性指數(shù)Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)差異不顯著的原因。

各組擬桿菌門和硬壁菌門均為優(yōu)勢(shì)菌門，不同飼喂組均未發(fā)現(xiàn)特有菌門，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致［5，8－9］，擬桿菌門和硬壁菌門有時(shí)可高達(dá)序列總量的50%和43%［8］，改變飼糧中纖維和淀粉比例也未改變它們的優(yōu)勢(shì)地位［5］。Thoetkiattikul等［5］發(fā)現(xiàn)在高纖維(88%)和低淀粉(2%)飼糧條件下，奶牛瘤胃中擬桿菌門和硬壁菌門菌門含量分別達(dá)到66.53%和24.98%，本研究中擬桿菌門數(shù)量低于上述結(jié)果可能與飼糧中纖維含量(50%)低有關(guān)。擬桿菌門是瘤胃中非纖維植物成分的主要降解者，該菌門中的普雷沃氏菌屬在瘤胃中含量最高，有報(bào)道稱普雷沃氏菌屬可達(dá)瘤胃微生物總量的60%～70%［10］，它擁有高活性的半纖維素分解菌［11］，并對(duì)植物非纖維多糖和蛋白質(zhì)的降解至關(guān)重要［12－13］。此外，普雷沃氏菌屬還具有消化和利用淀粉、木聚糖和果膠的能力［14－15］。瘤胃中硬壁菌門含有大量分解纖維的菌屬，如瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬、假丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬以及真桿菌屬［14］。本試驗(yàn)稻草組中硬壁菌門和擬桿菌門之和稍高于其他3組，這可能與稻草組飼糧降解速率更慢需要更多微生物參與降解有關(guān)。

圖1 屬水平下16個(gè)瘤胃液樣品的聚類分析Heatm apFig.1 Heatmap under the genus level of the 16 rumen fluid samples

山羊瘤胃中普雷沃氏菌屬、分支桿菌屬、琥珀酸菌屬、新月形單胞菌屬、丁酸弧菌屬和瘤胃球菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌屬［16］，該結(jié)果與本研究的差異可能是試驗(yàn)動(dòng)物和取樣部位的不同造成的。Pitta等［2］研究了肉牛飼喂百慕大干草(34 d)和小麥(28 d)后瘤胃液相、固相和混合相的細(xì)菌組成，結(jié)果表明，百慕大干草組優(yōu)勢(shì)菌為普雷沃氏菌屬和理研菌屬，分別占細(xì)菌總數(shù)的33%和28%，但小麥組中普雷沃氏菌屬高達(dá)56%。百慕大干草組中的坦納菌屬和解琥珀酸菌屬占細(xì)菌總數(shù)的1.0%～2.5%，但小麥組上述菌屬含量可上升到2%～8%。本研究中未發(fā)現(xiàn)存在理研菌屬和坦納菌屬，且解琥珀酸菌屬含量都低于0.5%，這可能與動(dòng)物種類和飼糧中牧草來源和精料組成相關(guān)聯(lián)。對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列分析表明普雷沃氏菌屬是瘤胃微生物中含量最多的菌屬，可高達(dá)42%～60%［17］，該菌屬在瘤胃液相中含量更高［18－19］，這與本研究中普雷沃氏菌屬相對(duì)含量最高的結(jié)論相一致。

本研究瘤胃液中還發(fā)現(xiàn)了很多低豐度菌門。變形菌門中含有大量可以降解飼料的菌群［14］。螺旋體門在瘤胃細(xì)菌中占的比例也不高，研究表明螺旋體門可以有效降解纖維素、果膠和磷酸酯，利用可發(fā)酵碳水化合物形成揮發(fā)性脂肪酸，為動(dòng)物機(jī)體提供能量［20］，本研究中不同牧草來源對(duì)螺旋體門含量無顯著影響。很多低豐度菌門可能存在某種特定功能，但還需要在不同飼糧試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。本研究瘤胃液中某些菌門和菌屬的相對(duì)含量會(huì)伴隨飼糧的改變而發(fā)生變化，這與飼糧結(jié)構(gòu)類型和不同牧草降解速率不同有關(guān)［5］，盡管有研究表明，即使奶牛飼喂相同飼糧瘤胃中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在一定程度的差異，但本研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧營(yíng)養(yǎng)組分均衡的條件下，不同牧草來源飼糧中瘤胃微生物存在一定的相似性，各組并未出現(xiàn)特定菌門和菌屬，且各組間細(xì)菌含量在數(shù)值上十分接近。與此同時(shí)，Heatmap和UniFrac主坐標(biāo)分析的結(jié)果也表明不同組瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)存在很高的相似性，且苜蓿組、燕麥草組和稻草組的細(xì)菌遺傳距離也非常接近。Xu等［21］先前研究發(fā)現(xiàn)，奶牛在飼喂上述相同的飼糧條件下，不同牧草來源并不影響奶牛泌乳性能(奶產(chǎn)量、乳脂率和乳蛋白率)、瘤胃發(fā)酵和微生物蛋白的合成，且干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和有機(jī)物消化率各組間也無顯著差異，這可能與該研究瘤胃液中的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性存在一定的相似性密切有關(guān)，我們推測(cè)正是由于瘤胃中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，才使得不同牧草來源的飼糧對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率無顯著影響，最終體現(xiàn)在對(duì)生產(chǎn)性能無不良作用。

圖2 97%相似性水平下16個(gè)瘤胃液樣品菌群結(jié)構(gòu)Unifrac加權(quán)主坐標(biāo)分析圖Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)generated by a weighted UniFrac analysis at the 97%sim ilarity level of the 16 rumen fluid samples

圖3 不同組對(duì)瘤胃液中細(xì)菌群落共享和獨(dú)有的OTU的Venn分析Fig.3 Venndiagram representation of the shared and exclusive OTUs among different groups.

4 結(jié)論

當(dāng)飼糧等能等氮且NDF和NFC含量相同時(shí)，不同牧草飼喂組瘤胃液中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性存在一定的相似性，結(jié)合前期研究的生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)表明，今后可考慮使用不同牧草飼喂泌乳中期奶牛并對(duì)奶牛無不良影響。

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