蛋白質(zhì)Z在肺腺癌的表達(dá)及其臨床意義＊

黃 方，潘學(xué)誼，王 宏，劉亞楠，關(guān)則兵，郭 煜，李銘杰，曾文彬，徐之龍（廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科，廣州510080）

凝血系統(tǒng)在腫瘤轉(zhuǎn)移和血栓形成中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)Z（protein Z，PZ）作為蛋白質(zhì)Z依賴的蛋白酶抑制劑（protein Z－dependent protease inhibitor，ZPI）的輔因子，主要在ZPI抑制FⅩa的過程中發(fā)揮間接抗凝作用。有研究發(fā)現(xiàn)PZ血漿水平隨著腫瘤病程進展而明顯下降，其下降可能是導(dǎo)致惡性腫瘤高凝狀態(tài)形成的一個新的機制，并可能成為惡性腫瘤預(yù)后不良因素之一［1－2］。最新研究發(fā)現(xiàn)PZ可以在乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)或合成［3－5］，提示PZ與腫瘤之間可能存在著更深層的關(guān)系。本研究以免疫組織化學(xué)法及Western blot方法觀察人肺腺癌組織和正常肺組織中PZ的表達(dá)水平，結(jié)合臨床資料分析PZ與肺腺癌之間的關(guān)系，為腫瘤的早期診斷和治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選擇2008～2011年在本院接受手術(shù)治療的肺腺癌患者88例，肺大泡、炎性假瘤患者（非腫瘤）22例作正常肺組織對照組。66例為肺腺癌標(biāo)本，其中男34例，女32例，年齡27～82歲，平均59歲。TNM分期（2009年AJCC標(biāo)準(zhǔn)，第7版）：將肺腺癌組織分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期；其中，0期8例，Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。并將0～Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期分別分為早、中、晚期。低中分化32例，高分化34例。所有研究對象均對該研究項目知情同意，并獲得人類倫理協(xié)會許可。正常肺組織離體后，立即剔除壞死部分，將組織脫水、滲透后石蠟包埋。肺腺癌標(biāo)本離體后立即在腫瘤中心及邊緣部位取材，留取肺腺癌組織及周圍正常組織，盡量剔除壞死部分，分兩部分保存：一部分將組織脫水、滲透后石蠟包埋；另外一部分于液氮中浸置30min，轉(zhuǎn)至－80℃冰箱保存。所有病例術(shù)前均未放、化療并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確認(rèn)，且排除患有其他腫瘤、嚴(yán)重肝病、2周內(nèi)抗凝血及抗纖溶止血藥物治療、1個月內(nèi)有手術(shù)史、創(chuàng)傷史及合并感染史的患者。

1．2 主要試劑 鼠抗人PZ單克隆抗體（美國Lifespan公司），actin抗體（Abcam公司），堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（KPL公司），PVDF膜（Millipore公司）。

1．3 方法

1．3．1 免疫組織化學(xué)法檢測 按免疫組織化學(xué)法SP試劑盒說明書操作。冰凍組織標(biāo)本復(fù)融，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。高壓鍋修復(fù)抗原，一抗為鼠抗人PZ單克隆抗體（1∶1 600），二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1∶5 000），DAB顯色。PZ陽性表達(dá)物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。其中，不著色為陰性（－），淡棕黃色為弱陽性（＋），深棕黃色為強陽性（＋＋＋），介于弱陽性與強陽性之間為中度陽性（＋＋）。用13點評分法進行評分：（1）0～4分判定陽性細(xì)胞的百分比：沒有陽性細(xì)胞記為0分；陽性細(xì)胞百分比小于10%記為1分；＞10%～＜50%記為2分；＜80%記為3分；＞80%記為4分。（2）染色強度按陰性及弱、中、強陽性分別評0～3分。（3）最終的評分為2個指標(biāo)的乘積。

1．3．2 Western blot檢測 冰凍組織標(biāo)本塊裂解并超聲勻漿，低溫超速離心，BCA法測定蛋白濃度，10%SDS－PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，一抗（1∶2 500）4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記二抗（1∶20 000）室溫孵育2h，NBT／BCIP顯色；因組織蛋白有限，內(nèi)參actin欠齊，根據(jù)IPP軟件計算PZ與actin表達(dá)的灰度值，采用PZ／actin值做統(tǒng)計分析。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SSPS17．0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 免疫組織化學(xué)法檢測人肺組織標(biāo)本中PZ的表達(dá)情況PZ蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，在肺腺癌旁組織和正常肺組織中的肺上皮細(xì)胞不表達(dá)（圖1）；PZ蛋白同樣在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor－associated macrophages，TAMs）和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）中表達(dá)（圖1A），這與Sierko等［4］研究結(jié)果一致。本研究也可以看到PZ蛋白在正常肺組織中的巨噬細(xì)胞及ECs中表達(dá)（圖1C）。

本研究進行了22例正常肺組織、66例肺腺癌旁組織及66例肺腺癌組織PZ蛋白表達(dá)水平的臨床資料統(tǒng)計分析（表1），結(jié)果顯示：PZ在肺腺癌組織的表達(dá)水平明顯增加，與肺腺癌旁組織及正常肺組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），肺腺癌旁組織與正常肺組織PZ表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；肺腺癌早期與中期、晚期比較，PZ表達(dá)水平隨腫瘤的進展明顯增高（P＜0．01），但肺腺癌中期、晚期間PZ表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；肺腺癌低分化組與中分化組、高分化組比較，PZ表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；肺腺癌女性組與男性組PZ表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

圖1 PZ在人肺組織中的表達(dá)情況

表1 PZ在人肺組織的表達(dá)情況與臨床資料分析（x±s）

2．2 Western blot檢測人肺組織PZ的表達(dá)情況 PZ在肺腺癌組織的表達(dá)水平明顯高于肺腺癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；肺腺癌在早期、中期、晚期間比較，PZ表達(dá)隨腫瘤進展明顯增高（P＜0．05）；肺腺癌低分化組與中、高分化組間比較PZ表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；肺腺癌女性組與男性組PZ表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），見表2、圖2。肺腺癌1與癌旁1出自同一肺腺癌患者組織。

圖2 人肺腺癌組織與肺腺癌旁組織中的PZ表達(dá)

表2 肺腺癌PZ／actin比值表達(dá)情況比較（x±s）

3 討 論

PZ是1977年發(fā)現(xiàn)的一種新的維生素K依賴性糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員。其結(jié)構(gòu)與其他一些絲氨酸蛋白酶（如凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ）及抗凝蛋白（尤其是凝血因子Ⅺ、蛋白C和蛋白S）具有高度的同源性。在ZPI抑制FⅩa的作用中，PZ作為一種輔助因子使ZPI對FⅩa的抑制作用增強1 000倍以上［6］。PZ在臨床上研究較廣泛，在血栓性疾病、婦產(chǎn)科疾病、炎性疾病等疾病中起著重要的生物學(xué)作用。

凝血系統(tǒng)在腫瘤轉(zhuǎn)移和血栓形成中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于PZ與腫瘤關(guān)系的報道國內(nèi)外均不多，而且意見不一。Bolkun等［7］在多發(fā)性骨髓瘤的研究中認(rèn)為，PZ低血漿水平可能增加多發(fā)性骨髓瘤血栓形成的風(fēng)險，并與其分期、臨床療效相關(guān)。Galar等［8］對急性白血病的研究后認(rèn)為PZ缺乏與急性髓系細(xì)胞白血病嚴(yán)重程度相關(guān)。作者前期臨床研究［1－2］也發(fā)現(xiàn)PZ血漿水平隨著惡性實體瘤病程進展而明顯下降，其下降可能是導(dǎo)致惡性腫瘤高凝狀態(tài)形成的一個新的機制。因此，PZ血漿水平下降可能是惡性腫瘤預(yù)后不良因素之一。Cankal等［9］在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病誘導(dǎo)治療期的研究中，發(fā)現(xiàn)治療期間PZ血漿水平有明顯下降，但并不會導(dǎo)致癥狀性出血或血栓形成。在PZ的基因多態(tài)性方面，有學(xué)者認(rèn)為13A／G、G79A基因多態(tài)性不是腫瘤患者靜脈血栓形成的危險因素［10－11］。Sierko等［3－5］發(fā) 現(xiàn) PZ 可以在乳腺 癌細(xì)胞、肺 癌 細(xì) 胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)或合成，提示PZ與腫瘤之間可能存在著更深層的關(guān)系。同時，他們發(fā)現(xiàn)在癌組織中的TAMs和新生血管的ECs檢測到PZ的表達(dá)，并進一步研究了非小細(xì)胞型肺癌及結(jié)腸癌組織中PZ、ZPI、凝血活化標(biāo)志物凝血酶原片段（F1＋2）及纖維蛋白的表達(dá)及其相互關(guān)系［4－5］，認(rèn)為PZ可能其在腫瘤位點（或腫瘤組織內(nèi)）發(fā)揮抗凝血作用，從而可能影響到腫瘤的血管新生、侵襲和轉(zhuǎn)移［3－5］。

為了求證這種關(guān)系，并探索PZ在腫瘤細(xì)胞的過表達(dá)除了可能與腫瘤凝血事件相關(guān)之外，是否也意味著與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究選用了肺癌類型中最易早期轉(zhuǎn)移及血栓形成的肺腺癌作為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測了22例正常肺組織、66例肺腺癌旁組織及66例肺腺癌組織中PZ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PZ蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)，PZ在肺腺癌組織的表達(dá)明顯增加，與肺腺癌旁組織及正常肺組織比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），這與Sierko等［4］研究結(jié)果一致，提示PZ可能與腫瘤的發(fā)病相關(guān)；同時，在TAMs和新生血管ECs檢測到PZ蛋白表達(dá)（圖1），結(jié)合既往研究［3－5］，提示PZ可能與腫瘤的抗凝血作用相關(guān)，可能會影響到腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移和侵襲。

為進一步了解PZ蛋白在肺腺癌的表達(dá)情況，本研究采用Western blot方法分別檢測66例肺腺癌旁組織及66例肺腺癌組織中PZ蛋白的表達(dá)，并通過對免疫組織化學(xué)法及Western blot方法檢測PZ蛋白的表達(dá)情況進行統(tǒng)計分析，結(jié)果均顯示PZ在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于肺腺癌旁組織（P＜0．05，表1、2）。因此，認(rèn)為PZ蛋白確實在肺腺癌組織中過表達(dá)。前期研究［1－2］中PZ血漿水平在惡性實體瘤中降低，可見PZ蛋白在肺腺癌組織與血漿的表達(dá)水平不一致，目前國內(nèi)外暫無相關(guān)研究報道。推測原因可能為：（1）肺腺癌組織中的PZ蛋白主要表達(dá)在肺腺癌細(xì)胞，即PZ可能作為癌基因在肺腺癌細(xì)胞中合成分泌，與腫瘤的發(fā)病相關(guān)。而腫瘤細(xì)胞合成分泌的PZ蛋白，可能同時在腫瘤組織內(nèi)或腫瘤位點發(fā)揮抗凝血作用而被消耗，也可能不能通過肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜而未能釋放到血漿中，從而未能引起血漿水平的升高。（2）盡管PZ可能在肺腺癌細(xì)胞中合成分泌，血漿中的PZ仍主要由肝臟合成分泌，在腫瘤凝血事件中發(fā)揮作用，PZ血漿水平越低，越容易形成血栓［7－8］。（3）目前，引起腫瘤中PZ血漿水平降低的原因仍未明確，而惡性腫瘤是高凝狀態(tài)的常見病理過程，且越接近腫瘤晚期，凝血異常事件越高，同時消耗著凝血相關(guān)因子（包括PZ），進而PZ血漿水平可能隨著惡性實體瘤病程進展而下降，而這種腫瘤高凝狀態(tài)同時也可能刺激PZ進入腫瘤細(xì)胞中，在腫瘤組織內(nèi)或腫瘤位點發(fā)揮抗凝血作用。

同時，為探討PZ與腫瘤發(fā)病及進展的關(guān)系，作者首次對檢測的結(jié)果進行了分期、分化和性別的臨床資料分析。發(fā)現(xiàn)PZ蛋白在中、晚期肺腺癌組的表達(dá)明顯高于早期肺腺癌組（P＜0．01，表1、2），推測其表達(dá)可能與肺腺癌的分期相關(guān)，即肺腺癌越接近晚期，PZ表達(dá)可能越高。但在中、晚分期肺腺癌組織的表達(dá)中，Western blot方法與免疫組織化學(xué)方法得出結(jié)論不一致（表1、2），作者分析原因可能如下：（1）Western bolt方法檢測的是肺組織的總蛋白，除了包含肺腺癌細(xì)胞及正常肺上皮細(xì)胞的蛋白，還有血液及肺間質(zhì)細(xì)胞等多種蛋白成分，因此，這些因素可能在一定程度上影響了Western blot方法的檢測結(jié)果。（2）目前，統(tǒng)計數(shù)量仍較小，也有可能存在統(tǒng)計誤差。（3）腫瘤病理生理環(huán)境是復(fù)雜的，存在許多特殊的基因及作用機理，晚期肺腺癌患者多合并凝血障礙，也有可能會促使癌細(xì)胞內(nèi)的PZ分泌到細(xì)胞外，與ZPI結(jié)合起抗凝血作用，因此，腫瘤后期癌細(xì)胞內(nèi)的PZ可能會減少。究竟PZ表達(dá)是否與肺腺癌的進展或凝血異常相關(guān)，仍需要進一步研究。

在腫瘤分化的統(tǒng)計分析中，結(jié)果顯示PZ蛋白在低分化組的表達(dá)明顯高于中高分化組（P＜0．01），表明其表達(dá)可能與肺腺癌的分化程度密切相關(guān)（表1、2）。眾所周知，低分化的肺腺癌惡性度高，預(yù)后較差，推測PZ表達(dá)可能與肺腺癌的惡性程度正相關(guān)，即肺腺癌分化程度越低，惡性程度越高，預(yù)后越差，PZ表達(dá)可能越高。而PZ在性別組的統(tǒng)計分析中，PZ的表達(dá)在女性組與男性組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），可能表明PZ在肺腺癌的表達(dá)無性別差異（表1、2）。綜上所述，作者推測PZ在肺腺癌高表達(dá)可能參與了肺腺癌的發(fā)生及進展過程，可能是腫瘤惡性程度及預(yù)后的一個重要指標(biāo)，也可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移與血栓形成中發(fā)揮一定的作用。

尋找腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中起作用的未知新基因，闡明腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移機理是目前腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點。PZ在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)究竟是在腫瘤位點發(fā)生了抗凝血作用引起的？還是本來腫瘤細(xì)胞中就分泌表達(dá)PZ，而對腫瘤的高凝狀態(tài)起保護作用？或是在腫瘤的發(fā)生、進展、侵襲及轉(zhuǎn)移中起作用？對PZ的進一步深入研究有可能為人類惡性腫瘤的預(yù)防和治療方法提供新的思路。

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