高脂高果糖飲食與維生素D缺乏對(duì)小鼠牙齦菌群影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

楊 宓，柏 雪

（四川省成都市第四人民醫(yī)院口腔科 610036）

牙周病是一種微生物感染性疾病，致病性微生物是引發(fā)牙周病必不可少的始動(dòng)因素，人群發(fā)病率高達(dá)90%以上［1］。飲食偏好會(huì)導(dǎo)致其牙周菌群的改變，進(jìn)而影響宿主的牙周健康，如大量臨床調(diào)查或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明高脂高糖飲食導(dǎo)致牙周疾病的發(fā)生［2－4］。有研究表明，維生素D缺乏可能是牙周疾病產(chǎn)生的重要促進(jìn)因素［5］。中國(guó)約50%的人群缺少維生素D，對(duì)牙周健康具有較大的潛在風(fēng)險(xiǎn)。既往研究多著眼于高脂高糖飲食與維生素D缺乏分別獨(dú)立作用下的牙周病變；而關(guān)于在二者即雙因素共同作用下牙周炎罹患情況的相關(guān)研究則未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用維生素D受體缺失的小鼠，通過(guò)建立高脂高果糖飲食動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，運(yùn)用PCR－變形梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR－DGGE）對(duì)齦溝液中的菌群進(jìn)行多樣性分析，探究?jī)煞N因素對(duì)牙周炎致病菌群的影響，并進(jìn)一步探討牙周病致病相關(guān)因素。

1 材料與方法

1．1 主要材料 雄性4周齡C57BL／6J野生型小鼠20只，雄性4周齡維生素D受體基因敲出C57BL／6J野生型小鼠20只，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分別將正常型和基因敲出型小鼠各自隨機(jī)分為兩組（每組10只），給予不同飲食喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分成如下4組：正常型正常飲食組（N組）、正常型高脂高果糖飲食組（H組）、維生素D受體缺失的正常飲食組（DN組）、維生素D受體缺失的高脂高果糖飲食組（DH組）。PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀（Bio－RAD公司，美國(guó)），DYY－6C型電泳儀（北京六一儀器廠），PCR緩沖體系（由上海生工生物工程有限公司提供）。

1．2 牙齦溝液采集方法 按照分組的飲食條件喂養(yǎng)10周［6］。采樣前饑餓12h，0．1%戊巴比妥鈉（50mg／kg，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）麻醉后，用whatman 1號(hào)濾紙?zhí)崛⌒∈笙骂M第2磨牙齦溝液。定量后用生理鹽水溶解，－80℃保存。

1．3 DNA提取 樣本室溫解凍，加入0．5mL裂解緩沖液（50mmol／L Tris，20mmol／L EDTA，50mmol／L NaCl溶液，pH 8．0），加入溶菌酶至濃度10mg／mL。37℃水浴10min，然后加入十二烷基硫酸鈉（SDS）至1%（質(zhì)量／體積），加入蛋白酶K至0．1mg／mL，37℃水浴30min。利用酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）提取，然后用2倍體積無(wú)水乙醇沉淀DNA，最后用不含DNase的RNase去除RNA，DNA樣品用于PCR擴(kuò)增。

1．4 PCR擴(kuò)增 PCR引物：細(xì)菌微生物屬種的變化使用16 Sr RNA V3作為擴(kuò)增引物：5′－ATT ACC GCG GCT GCT GG－3′；下游引物：5′－GC clamp＊－TAC GGG AGG CAG CAG－3′［7］（上海生工生物工程有限公司合成）。PCR反應(yīng)體系：DNA模板0．005mL，上下游引物（0．01mmol／L）各0．000 5mL，10×緩沖液（不含 MgCl2）0．002 5mL，MgCl2（2．5mmol／L）0．002 mL，10mmol／L脫氧核糖核苷三磷酸0．000 5mL，1UL 的TaqDNA聚合酶（上海生工生物工程有限公司），無(wú)菌三蒸水補(bǔ)足總體積至0．025mL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min，變性94℃30s，退火55℃60s，延伸72℃90s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min，4℃保存。

1．5 DGGE分析 采用80g／L的聚丙烯酰胺凝膠，20%～70%的變性梯度（100%變性梯度包含體積分?jǐn)?shù)40%的甲酰胺和7mol尿素）。在220V電壓預(yù)電泳10min，接著85V電壓電泳16h，之后用硝酸銀染色［8］。采用Quantity One軟件對(duì)凝膠做相似性分析，計(jì)算條帶光密度值，然后對(duì)H組和DH組中有明顯優(yōu)勢(shì)的條帶，回收、克隆純化、測(cè)序，用GenBank中的Blast分析優(yōu)勢(shì)菌群。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件分析采集的數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 牙周臨床指標(biāo) N組、DN組小鼠牙齦偶見(jiàn)紅腫現(xiàn)象。H組小鼠大部分牙齦增厚發(fā)紅。DH組小鼠牙齦則呈現(xiàn)暗紅色，冠周出現(xiàn)組織壞死且探診出血。H組、DH組小鼠牙齦指數(shù)、牙周袋深度方面與N組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），且有不同程度松動(dòng)，見(jiàn)表1。

表1 喂養(yǎng)10周后4組小鼠牙周臨床指標(biāo)比較（x±s）

2．2 PCR－DGGE牙周菌群多樣性分析 同組中小鼠的條帶數(shù)量和分布有較好的一致性，而不同組小鼠之間的條帶數(shù)量和分布差異性明顯，尤其是維生素D缺乏的2個(gè)小組（圖1）。通過(guò)UMPGA相似聚類(lèi)分析表明，各組內(nèi)相似性很高，但各組之間相似性較小（圖2）。DGGE圖譜顯示，維生素D缺乏的DH組、DN組與維生素D不缺乏的N組、H組在豐富度和多樣性指數(shù)方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表2。

圖1 DGGE圖譜

圖2 UMPGA相似聚類(lèi)分析

橫坐標(biāo)為相似百分比，縱坐標(biāo)為條帶序列號(hào)。

表2 DGGE圖譜多樣性分析（x±s）

表3 優(yōu)勢(shì)菌序列分析結(jié)果

2．3 測(cè)序結(jié)果 選擇有肉眼可見(jiàn)病變的H組和DH組開(kāi)展優(yōu)勢(shì)菌分析。條帶如圖1中的箭頭標(biāo)示。經(jīng)過(guò)BLAST測(cè)序分析，結(jié)果見(jiàn)表3，H組中條帶1與福賽斯坦納菌屬有99%的同源性；條帶2與牙卟啉單胞菌屬有99%的同源性；條帶3與中間普雷沃菌屬有99%的同源性。DH組中條帶4與放線共生放線桿菌屬具有99%的同源性；條帶5與牙卟啉單胞菌屬有99%的同源性；條帶6與脆弱擬桿菌屬有99%的同源性；條帶7中間普雷沃菌屬具有99%的同源性。

3 討 論

研究表明高脂高糖飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂可導(dǎo)致個(gè)體牙周疾病發(fā)生［2，9］，而維生素D的缺乏是否也是牙周炎發(fā)生的促進(jìn)因素尚存爭(zhēng)議［5］。現(xiàn)有文獻(xiàn)均著重于二者作為獨(dú)立因素作用的結(jié)果，為進(jìn)一步研究維生素D缺乏及二者共力與牙周疾病的關(guān)系［2］，本實(shí)驗(yàn)建立了高脂高果糖飲食以及缺乏維生素D受體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)了小鼠的牙周組織臨床指標(biāo)、齦溝液菌群的差異性等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牙周臨床指標(biāo)的數(shù)據(jù)顯示正常飲食的N組和DN組小鼠偶見(jiàn)牙齦紅腫的現(xiàn)象，高脂高果糖飲食的H組與DH組小鼠牙齦有明顯炎癥，且牙齦指數(shù)、牙周袋深度均顯著高于正常飲食組。表明高脂高糖飲食可以促進(jìn)牙周病的發(fā)生，與 Blasco－Baque等［2］和 Amano等［5］研究結(jié)果一致；DH組小鼠牙齦指數(shù)、牙周袋深度及活動(dòng)度均顯著高于其他組，提示在高脂高果糖飲食和缺少維生素D的雙重作用下，可能更易罹患牙周病。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DN組小鼠無(wú)明顯炎性反應(yīng)，提示在維生素D缺乏的單一條件下，正常飲食喂養(yǎng)不一定會(huì)引起牙周病。

DGGE多樣性分析顯示，H組、DN組、DH組小鼠的豐富度和多樣性指數(shù)顯著高于N組小鼠，說(shuō)明其他3組小鼠齦下菌群有明顯增加。與之相一致的是，H組和DH組小鼠有肉眼可見(jiàn)的明顯炎癥，提示高脂高糖的飲食無(wú)論作為獨(dú)立因素還是合并維生素D缺乏因素，都可能致使口腔菌群變化，并促使了炎癥形成［10－11］。在DN組，雖測(cè)及齦下菌群的增加，卻沒(méi)有發(fā)生相應(yīng)的臨床炎性表現(xiàn)。而以往有文獻(xiàn)稱(chēng)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)維生素D缺乏可促使牙周病產(chǎn)生［5］，但本研究?jī)H進(jìn)行10周，有可能致病菌致病力不夠或刺激時(shí)間尚短，因此未能在菌群增加的情況下致炎。

UMPGA聚類(lèi)分析顯示各組間有顯著差異，這說(shuō)明在高脂高糖飲食和維生素D缺乏無(wú)論作為獨(dú)立還是合并刺激因素，都可導(dǎo)致齦下菌群種類(lèi)和數(shù)量的變化［10］；但組內(nèi)相似性較高，說(shuō)明外環(huán)境因素（如溫度、濕度等飼養(yǎng)條件）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本無(wú)影響。測(cè)序結(jié)果顯示H組和DH組均檢測(cè)出優(yōu)勢(shì)中間普雷沃菌和牙卟啉單胞菌，提示高脂高糖飲食可能為這兩種菌生長(zhǎng)提供有利內(nèi)環(huán)境，從而促進(jìn)了牙周炎的形成；但二者是共同還是獨(dú)立致病需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，在DH組查及放線共生放線桿菌、脆弱擬桿菌等牙周可疑致病菌［12－14］，其中放線共生放線桿菌致病能力較強(qiáng)，協(xié)調(diào)前兩種菌的共同作用也可部分解釋DH組臨床癥狀更為嚴(yán)重的原因。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究齦溝液中細(xì)菌種群和數(shù)量的變化，認(rèn)為維生素D缺乏對(duì)高脂高糖所致牙周炎的發(fā)展有正協(xié)同作用，進(jìn)而提示在牙周病的臨床防治過(guò)程中，除要求患者少食高脂高糖食物外，還可適量補(bǔ)充維生素D［15］。

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