過表達核糖核酸酶抑制因子對膀胱癌移植瘤侵襲轉(zhuǎn)移及上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響＊

舒 靜，姜 源，姚 雪，陳俊霞

（1．瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川瀘州646000；2．重慶市衛(wèi)生信息中心《重慶醫(yī)學》編輯部 401120；

3．重慶醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學與遺傳學教研室分子醫(yī)學與腫瘤研究中心 400016）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中常見的多發(fā)性腫瘤，位居世界惡性腫瘤的第5位。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個癌細胞與宿主細胞及基質(zhì)相互作用的連續(xù)過程，即脫落、侵襲、循環(huán)、增殖形成腫瘤的轉(zhuǎn)移灶。上 皮 間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化［1］（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是多細胞胚胎發(fā)育與器官形成中的基礎(chǔ)過程，是胚胎發(fā)育中形態(tài)發(fā)生過程的主要部分，在EMT過程中上皮細胞獲得間質(zhì)細胞的特征——細胞間黏附減弱、運動性增強、細胞間基質(zhì)降解等。近年來研究發(fā)現(xiàn)［2］，EMT在腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，EMT使沒有侵襲、遷移能力的細胞獲得浸潤能力并最終轉(zhuǎn)移到其他組織和器官，并再次通過間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化定植形成轉(zhuǎn)移灶。上皮標志物（E－cadherin）的下調(diào)與間質(zhì)標志物（N－cadherin）的上調(diào)是EMT的主要特征之一。此外，鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Slug、Snail）也是EMT主要調(diào)節(jié)因子，通過與靶基因啟動子結(jié)合，誘導EMT的發(fā)生，促使腫瘤細胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移［3］；而堿性螺旋環(huán)轉(zhuǎn)錄因子（Twist）通過抑制細胞凋亡與分化，誘導細胞上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，其高表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移與預后相關(guān)［4］。因此，本文通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，觀察移植瘤的生長、微血管形成等，并檢測移植瘤組織中侵襲轉(zhuǎn)移、EMT相關(guān)分子蛋白的表達，研究核糖核酸抑制因子（ribonuclease inhibitor，RI）基因?qū)Π螂装㏕24細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑及動物 人膀胱癌細胞株T24、pIRES2－EGFP、pIRES2－EGFP－RI質(zhì)粒以及一抗（兔抗人RI）由重慶醫(yī)科大學細胞生物學及遺傳學教研室保存；BALB／C裸鼠5～6周齡，（20±3）g，購自北京大學動物實驗中心；兔抗人CD31抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司；Dylight 488標記的二抗（山羊抗兔IgG）購自北京鼎國公司；兔抗 E－cadherin、N－cadherin、MMP－2、MMP－9、Vimentin、Snail、Slug、Twist一抗購于 Bioworld公司；免疫組織化學染色試劑盒、DAB染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 T24細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及鑒定 用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)T24細胞，取對數(shù)生長期細胞以每孔2×106細胞接種至6孔板中，待細胞融合度達70%，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染T24細胞。轉(zhuǎn)染48h后用G418篩選，15d后采用有限稀釋法獲取單克隆細胞團。

1．2．2 裸鼠移植瘤模型 取0．1mL含有2×105／mL的各組對數(shù)期細胞，PBS制備細胞懸液后分別接種于裸鼠左腋皮下，每組8只。記錄各組小鼠成瘤時間，21d后處死小鼠，稱重并計算抑瘤率。抑瘤率＝（對照組腫瘤質(zhì)量－實驗組腫瘤質(zhì)量）／對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

1．2．3 HE染色 4%多聚甲醛固定組織標本、5μm石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟水化后蘇木精染色4～5min、飽和碳酸鋰分色5s，沖洗后伊紅復染2min，梯度乙醇分別脫水1s，二甲苯透明后封片，在顯微鏡下對5個不同視野的高密度微血管區(qū)域進行計數(shù)。

1．2．4 免疫組織化學染色和免疫熒光分析 4%甲醛固定腫瘤組織、5μm石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟水化及抗原修復、3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶及5%血清封閉，一抗孵育［RI（1∶250稀釋）、Vimentin（1∶150稀釋）、E－cadherin、N－cadherin、MMP－2、MMP－9、Snail、Slug、Twist（1∶200稀釋）］于4℃冰箱中過夜；PBS清洗5min／次×3次，加入二抗生物素化羊抗兔IgG于37℃濕盒并孵育30min，加入辣根酶標記鏈酶卵白素溶液，37℃孵育10～20min，滴加DAB溶液，蘇木精復染及封片，顯微鏡下觀察拍片。組織免疫熒光：10μm冰凍切片，10%甲醛固定25min，2%Triton通透10min，BSA封閉25min，一抗CD31（1∶100稀釋）于4℃孵育過夜，PBS洗3遍，加入二抗羊抗兔Dylight 488的IgG（1∶50）37℃避光孵育2h，PBS洗3遍，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下拍照，并分析瘤組織切片的熒光強度。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11．5軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，配對組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 過表達RI對T24裸鼠移植瘤生長的影響 裸鼠移植瘤生長結(jié)果：T24－RI［（0．080 833±0．072）g］組較 T24［（0．282 7±0．083）g］與T24－Vector［（0．273 5±0．174）g］組，瘤體質(zhì)量顯著降低（P＜0．05），抑瘤率分別為26．67%和38．85%。

2．2 過表達RI對T24裸鼠移植瘤微血管的影響 裸鼠瘤組織HE染色結(jié)果（圖1）顯示，與兩對照組比較，T24－RI組移植瘤微血管明顯少于兩對照組（P＜0．01）。此外，組織免疫熒光結(jié)果也呈現(xiàn)相同趨勢（圖1－e），CD31抗體在T24－RI組中呈現(xiàn)弱陽性，而T24組及T24vector組呈強陽性。表明過表達RI基因抑制了腫瘤細胞的增殖及微血管的形成從而抑制腫瘤的生長。

2．3 過表達RI對T24裸鼠移植瘤肺部轉(zhuǎn)移的影響 與兩對照組比較，T24－RI組肺組織未見轉(zhuǎn)移灶，而兩對照組在血管周圍均可見明顯的細胞團－－細胞核增大、核染色加深且核質(zhì)比例失調(diào)，表明已發(fā)生體內(nèi)轉(zhuǎn)移（圖2）。

2．4 過表達RI對T24裸鼠移植瘤組織中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白

表達的影響 移植瘤組織免疫組織化學染色結(jié)果顯示，與T24 vector組和T24組比較，T24－RI組RI、E－cadherin蛋白表達明顯增加，而 N－cadherin、MMP－2、MMP－9、Vimentin、Snail、Slug、Twist蛋白表達明顯降低（圖3）。表明過表達的RI可以在裸鼠移植瘤組織中抑制侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵蛋白的表達。

圖1 各組移植瘤組織HE染色和免疫熒光CD31的微血管密度分析

圖2 HE染色觀察裸鼠瘤肺組織轉(zhuǎn)移（×200）

圖3 免疫組織化學染色觀察各組移植瘤組織中RI、E－cadherin等蛋白的表達（×200）

3 討 論

人核糖核酸酶抑制因子是一個分子量為50kD的胞漿內(nèi)酸性糖蛋白，在核酸及蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用。RI是核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNaseA）的抑制劑，能與中性和堿性RNas A以等比的化學計量密切結(jié)合，從而抑制其酶活性。進一步研究表明［5］，RI是一個多功能的蛋白調(diào)節(jié)分子，可通過對RNase A的抑制引起RNA庫的改變，進而影響蛋白質(zhì)的合成速率；還可以與血管生長因子（angiogenesis factors）以及成纖維生長因子（b－FGF）緊密結(jié)合，抑制血管及新生血管的生成。此外，RI包含7個串聯(lián)的亮氨酸殘基重復片段（leucinrich repeat，LRRs）結(jié)構(gòu)，其合成的蛋白質(zhì)更展示了豐富的功能，如參與調(diào)節(jié)細胞周期、細胞黏附、RNA剪切、信號傳導以及抑制酶活性等。RI定位于11號染色體的短臂末端（11p15．5），與ras和胰島素生長因子（IGF－2）基因鄰近，此部位與生長調(diào)控和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此，作者推測RI基因可能還存在尚未發(fā)現(xiàn)的生物學功能。作者前期研究證實，RI在多種腫瘤細胞中表達下調(diào)，如人胃癌細胞系（bgc－823）、人前列腺癌細胞系（DU－145）和人乳腺癌細胞系（MCF－7）等，采用甲基化抑制劑處理后RI的表達恢復［6］；新近實驗研究顯示［7－8］，RI不僅可在體外抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移、改變細胞黏附、調(diào)節(jié)細胞周期、誘導細胞凋亡以及抑制血管生成外，還可在體內(nèi)顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移。然而，這些研究未能全面闡明RI的功能及其抑癌的分子機制。RI的表達水平與裸鼠移植瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移以及EMT發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。為了進一步了解RI的功能以及探討RI與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本文通過研究過表達RI對裸鼠移植瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT發(fā)生的影響，為探討其相關(guān)分子機制提供理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，過表達的RI顯著抑制了膀胱癌移植瘤的生長，與其他兩對照組比較，有較低的瘤重，更長的成瘤潛伏期及其抑瘤率分別為26．67%和38．85%。腫瘤的生長轉(zhuǎn)移與微血管的生成密切相關(guān)，CD31是血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1，與血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合，參與腫瘤細胞生長、侵襲與轉(zhuǎn)移，是臨床廣泛應(yīng)用的血管標記物［9］。為進一步分析RI對膀胱癌移植瘤血管生成的影響，本實驗通過檢測肺部轉(zhuǎn)移情況，微血管計數(shù)以及CD31血管內(nèi)皮細胞標志物的表達，結(jié)果顯示，T24－RI組肺組織未見明顯轉(zhuǎn)移灶，而兩對照組在血管周圍均可見細胞核增大、核染色加深且核質(zhì)比例失調(diào)的細胞團，表明已發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移；裸鼠瘤組織HE染色及組織免疫熒光染色結(jié)果也證實T24－RI組較對照組，有更低的腫瘤微血管密度。因此，RI基因的表達可能與膀胱癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，RI具有明顯抗腫瘤效應(yīng)可能與其抑制血管生成作用相關(guān)。

本研究初步探討上調(diào)的RI對膀胱癌移植瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT的作用機制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RI上調(diào)可抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，如MMP－2、MMP－9是降解Ⅳ型膠原纖維最重要的酶，高表達時會促進細胞外基質(zhì)降解，導致腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。Gao等［10］研究顯示，異常表達的 MMP－2、MMP－9與非浸潤性膀胱癌BIU－87轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，RI上調(diào)降低了MMP－2、MMP－9的表達，阻止細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制了膀胱癌T24細胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。EMT是上皮細胞與細胞外基質(zhì)相互作用中失去細胞極性獲得遷移與侵襲的能力，并具有間質(zhì)化細胞特性的生物學過程。EMT的發(fā)生與上皮細胞標記物的減少和間質(zhì)化標記物的增加密切相關(guān)。E－cadherin是一種鈣依賴性跨膜蛋白，廣泛參與同型細胞間的黏附，細胞骨架的穩(wěn)定，它的異常表達被認為與EMT的發(fā)生密切相關(guān)［11］。N－cadherin是鈣黏附素家族中的神經(jīng)鈣黏蛋白，其異常表達與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。Le等［13］研究報道，如在乳腺癌患者中E－cadherin蛋白表達明顯降低，而Vimentin表達增高，表明乳腺癌患者中也存在向EMT轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。而本實驗免疫組織化學染色結(jié)果顯示，T24－RI組與兩對照組比較，上皮細胞標志物E－cadherin表達顯著升高，而間質(zhì)化標志物Vimentin和N－cadherin表達明顯降低。結(jié)果提示，RI基因可能通過調(diào)節(jié)EMT關(guān)鍵蛋白的表達水平，增加了細胞之間的黏附力，阻止腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移，從而降低了移植瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。此外，研究表明，腫瘤的發(fā)生與一系列轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子可能直接或間接識別其基因序列（E－bax）并結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄和表達，從而導致上皮細胞向間質(zhì)化轉(zhuǎn)化的發(fā) 生［14］。Fendrich 等［15］已 發(fā) 現(xiàn) 轉(zhuǎn) 錄 因 子 （Slug、ZEB1、Twist及E12／E47等）的異常表達可以促使腫瘤細胞向EMT轉(zhuǎn)化的發(fā)生，使腫瘤細胞獲得運動、遷移的能力以及腫瘤細胞之間黏附力降低，為惡性腫瘤發(fā)展與惡化提供重要的條件。本研究結(jié)果證實，過表達的RI通過降低相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Snail、Slug、Twist）蛋白表達的表達，阻止上皮細胞向間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，顯著抑制裸鼠移植瘤的生長與轉(zhuǎn)移，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。

綜上所述，RI基因與細胞的增殖、黏附、遷移、轉(zhuǎn)移、侵襲的能力以及EMT的發(fā)生密切相關(guān)，高表達的RI能顯著抑制膀胱癌移植瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力。這些發(fā)現(xiàn)能為進一步探討RI的功能及機制提供理論依據(jù)，同時也可能作為治療腫瘤新的靶點。

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