人胎胃成纖維細(xì)胞hTERT和端粒酶的表達(dá)＊

程永波，郭麗萍，王 磊，房殿春△

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，烏魯木齊830054；2．第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400038）

一般認(rèn)為，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒酶多表達(dá)于絕大部分癌細(xì)胞和少數(shù)正常高增殖細(xì)胞如造血干細(xì)胞、基底表皮細(xì)胞等，正常成熟細(xì)胞尤其是成纖維細(xì)胞檢測(cè)不到hTERT和端粒酶活性［1－3］。但近年來(lái)一些研究證實(shí)hTERT和端粒酶在成人成纖維細(xì)胞中有表達(dá)［2－4］，以往的研究也證實(shí)了hTERT和端粒酶可以在成人胃成纖維細(xì)胞中表達(dá)［5］。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，作者初步檢測(cè)了hTERT和端粒酶在人胎胃成纖維細(xì)胞的表達(dá)，以期彌補(bǔ)有關(guān)研究的不足。

1 材料與方法

1．1 材料 膠原酶Ⅱ（Sigma），分散酶（Roche）；Ham F12培養(yǎng)液和胎牛血清（GIBCO），培養(yǎng)皿（Corning）；端粒酶檢測(cè)試劑盒（北京鼎國(guó)），hTERT兔抗人一抗、TRITC標(biāo)記羊抗兔二抗

（中杉金橋），CK－18小鼠抗體和FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；DAPI（Vector Laboratories）。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)過(guò)學(xué)校、醫(yī)院倫理委員會(huì)和人流者同意，由引產(chǎn)死胎取胎胃，3個(gè)月胎齡。采用磁性攪拌酶分離法分離細(xì)胞［6］，接種于塑料培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)。CK－18免疫細(xì)胞化學(xué)染色排除上皮細(xì)胞。

1．3 hTERT免疫細(xì)胞化學(xué)觀察 細(xì)胞固定、透膜處理后一抗4℃孵育13h，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗常溫避光孵育40min，DAPI核染色后封片，Leica TCS SP5激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1．4 端粒酶活性檢測(cè) 采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）。上游引物：5′－ATT CCG TCG AGC AGA GTT－3′，下游引物：5′－CCC TTA CCC TTA CCC TAA－3′（FITC標(biāo)記）。步驟：細(xì)胞消化后離心，提取蛋白；取蛋白上清、上游引物與PCR反應(yīng)液20℃溫育40min，90℃3min滅活端粒酶。加入下游引物和Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。聚丙烯酰胺凝膠電泳3h。以熱處理后的蛋白上清作為陰性對(duì)照，已證明有端粒酶活性的成人胃成纖維細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)室有凍存）作陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)對(duì)二者的端粒酶活性作比較。ABIPrism 377測(cè)序儀分析膠圖。

2 結(jié) 果

2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞分離后，培養(yǎng)到第9天可見(jiàn)成片成纖維細(xì)胞，CK－18免疫染色陰性，見(jiàn)圖1。

2．2 hTERT表達(dá) 原位監(jiān)測(cè)胎胃成纖維細(xì)胞hTERT表達(dá)呈陽(yáng)性，胞質(zhì)和胞核中均可見(jiàn)細(xì)顆粒狀FITC紅色熒光，陰性對(duì)照胞質(zhì)和胞核中都未見(jiàn)熒光，見(jiàn)圖2。

2．3 端粒酶活性 胎胃成纖維細(xì)胞可觀察到端粒酶延伸的端粒片斷，長(zhǎng)度約為170bp，略高于與陽(yáng)性對(duì)照組成人胃成纖維細(xì)胞（160bp），陰性對(duì)照未見(jiàn)延伸的端粒片斷，見(jiàn)圖3。

圖1 人胎胃成纖維細(xì)胞形態(tài)和CK－18免疫染色（×100）

圖2 人胎胃成纖維細(xì)胞hTERT表達(dá)

圖3 人胎胃成纖維細(xì)胞端粒酶活性

3 討 論

端粒酶可以通過(guò)延伸端粒長(zhǎng)度使細(xì)胞避免老化和死亡，因此其多與細(xì)胞增殖有關(guān)。95%以上的癌細(xì)胞不同程度地表達(dá)端粒酶［7］，正常體細(xì)胞中少數(shù)增生能力強(qiáng)的如滋養(yǎng)層細(xì)胞、造血干細(xì)胞、子宮內(nèi)膜細(xì)胞等也可檢測(cè)到端粒酶活性。端粒酶的組分之一hTERT表達(dá)是端粒酶活性的限速步驟，其表達(dá)水平和端粒酶的活性高低基本平行［8－10］。成纖維細(xì)胞是一種多形性細(xì)胞，是機(jī)體組織的主要修復(fù)細(xì)胞。在靜息狀態(tài)下其增生較弱或不增生，被稱為纖維細(xì)胞，但在組織損傷修復(fù)過(guò)程中則表現(xiàn)出多種功能活性，增殖便是其中之一［11］。在這一階段，檢測(cè)到hTERT和端粒酶表達(dá)是和上述理論相符合的。成纖維細(xì)胞的離體培養(yǎng)，實(shí)際上也是一個(gè)不斷分裂增殖的過(guò)程，理論上也應(yīng)該有hTERT和端粒酶表達(dá)，不管是成人還是胎兒的，都應(yīng)如此，這在既往［5］和現(xiàn)在的研究中也得到了證實(shí)。在實(shí)際操作中，從光鏡下形態(tài)學(xué)和hTERT細(xì)胞免疫結(jié)果看胎胃和成人胃成纖維細(xì)胞分裂增殖能力無(wú)明顯差別，但從端粒酶的延伸片斷長(zhǎng)度看，前者要略長(zhǎng)于后者，說(shuō)明前者的增生能力要強(qiáng)于后者，這也符合常理。

成纖維細(xì)胞在組織創(chuàng)傷、炎癥后的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但在修復(fù)過(guò)程中，若成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖則會(huì)引起一些病理性變化如皮膚瘢痕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特征性血管翳等；其他如肺纖維化、肝硬化、心瓣膜病等都與成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)［11］。以往和現(xiàn)在的研究采用成人和胎胃成纖維細(xì)胞為工具，證實(shí)它們都表達(dá)hTERT和端粒酶，這為成纖維細(xì)胞合理修復(fù)的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)；另外，也為除細(xì)胞因子外，從hTERT和端粒酶為切入點(diǎn)預(yù)防成纖維細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中的弊端提供了一種新的思路。

［1］ Masutomi K，Yu EY，Khurts S，et al．Telomerase maintains telomere structure in normal human cells［J］．Cell，2003，114（3）：241－253．

［2］ Ge Z，Liu C，Bjrkholm M，et al．Mitogen－activated protein kinase cascade－mediated histone H3phosphorylation is critical for telomerase reverse transcriptase expression／telomerase activation induced by proliferation［J］．Mol Cell Biol，2006，26（3）：230－237．

［3］ Nakayama J，Tahara H，Tahara E，et al．Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas［J］．Nat Genet，1998，18（370）：65－68．

［4］ Philippi C，Loretz B，Schaefer UF，et al．Telomerase as an emerging target to fight cancer－－opportunities and challenges for nanomedicine［J］．J Control Release，2010，146（3）：228－240．

［5］ Cheng YB，Guo LP，Yao P，et al．Telomerase and hTERT：Can they serve as markers for gastric cancer diagnosis［J］World J Gastroenterol，2014，20（40）：6615－6619．

［6］ 程永波，房殿春，郭立萍，等．一種簡(jiǎn)便的人正常胃黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法［J］．胃腸病學(xué)，2007，12（1）：31－35．

［7］ Sabah M，Path M，Cummins R，et al．Immunohistochemical detection of hTERT protein in soft tissue sarcomas correlation with tumor grade［J］．Appl Immun，2006，14（2）：198－202．

［8］ Horilawal I，Barrett JC．Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and Viral oncogenic mechanisms［J］．Carcinogenesis，2003，24（20）：1167－1176．

［9］ Guilleret I，Benhattar J．Demethylation of the human telomerase catalytic subunit（hTERT）gene proII］Ioter reduced hTERT expression and telomerase actiVity and shortened telomeres［J］．Exp Cell Res，2003，289（4）：326－334．

［10］Braunstein I，Cohen－Barak O，Shachaf C，et al．Human telomerase reVerse transcriptase pronloter regulation in nomal and malignant human ovarian epithelial ceUs［J］．Cancer Res，2001，61（60）：5529－5536．

［11］李忠廉，崔乃強(qiáng)．成纖維細(xì)胞的雙重特性［J］．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2008，14（2）：176－179．