夾脊電針對(duì)兔退變腰椎間盤(pán)組織中decorin蛋白表達(dá)的影響

黃國(guó)付，汪伯毅，鄒璟，王華，張?zhí)品?/p>

椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨贅形成、椎間盤(pán)突出等一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)[1]。針灸在腰椎間盤(pán)退行性疾病的保守治療中一直備受青睞，前期研究也證實(shí)了電針對(duì)腰椎間盤(pán)退行性疾病有良好的療效[2-3]，但其作用機(jī)制尚不十分明確。本研究擬構(gòu)建腰椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型，通過(guò)觀察夾脊電針對(duì)兔退變腰椎間盤(pán)組織中基質(zhì)成分表達(dá)的影響，試圖探討夾脊電針?lè)乐窝甸g盤(pán)退變的可能機(jī)制，以期為臨床上應(yīng)用電針?lè)乐窝甸g盤(pán)退變性疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取40只骨骼發(fā)育成熟的健康雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量為3.5～4.0kg，均由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證書(shū)編號(hào)4200593344)。在武漢市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。②實(shí)驗(yàn)器材：軸向加壓造模器(湖北省十堰東風(fēng)汽車(chē)有限公司設(shè)備制造廠)，電鉆(上海銳奇工具股份有限公司)，Signa HDx 3.0T磁共振器(美國(guó)通用電氣公司)，針灸針(中美合作泰成科技發(fā)展有限公司，規(guī)格：0.30×25mm)，HANS穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，DYY-7C電泳儀電源，DYCZ-24DN垂直電泳槽，DYCZ-40電轉(zhuǎn)儀均由北京六一儀器廠提供；TS-1水平搖床(江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；③實(shí)驗(yàn)試劑：丙烯酰胺(Amresco)，PMSF，RIPA裂解液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均由碧云天公司提供；顯影定影試劑盒(武漢巴菲爾生物公司)，PVDF膜(Millipore)，GAPDH抗體(杭州賢至生物有限公司)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法 ①造模：參照Kroeber等[4]的造模方法構(gòu)建兔腰椎間盤(pán)退變的模型。先將實(shí)驗(yàn)兔固定于俯臥位，耳緣靜脈給予5%的水合氯醛(2ml/kg)麻醉；麻醉后定位出實(shí)驗(yàn)兔的L4和L5椎體棘突(兔髂棘約平L6椎體)；備皮后在椎旁同側(cè)予以記號(hào)筆標(biāo)記，局部進(jìn)行碘伏消毒；隨后在標(biāo)記處切開(kāi)約5mm的入口，逐層鈍性分離皮下筋膜及肌肉層形成開(kāi)口；將直徑約1.5mm的克氏針經(jīng)該入口沿額狀面穿入，依次穿過(guò)皮膚、筋膜、肌肉層直達(dá)骨面，然后探尋椎體靠尾側(cè)部分厚實(shí)處的腹側(cè)緣作為椎體穿針點(diǎn)；用電鉆將克氏針沿額狀面橫穿椎體后，依次經(jīng)過(guò)對(duì)側(cè)肌肉層、皮下筋膜層后穿出皮膚；縫合開(kāi)口處皮下筋膜和皮膚，最后在克氏針兩端連接椎間盤(pán)軸向施壓造模器，施以200N的壓力加壓28d(見(jiàn)圖1～3)。術(shù)后給予青霉素鈉40萬(wàn)單位肌肉注射，每天1次，連續(xù)治療5d；通過(guò)磁共振器判斷造模是否成功。②分組：40只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分成4組：正常組、模型組、假模型組及電針組，每組各10只。正常組：自然飼養(yǎng)，不予任何處理；模型組：于兔L4、L5椎體間橫穿克氏針，并施以軸向加壓造模器加壓，不做治療；假模型組：同模型組，但不予椎體間加壓，不做治療；電針組：于造模成功后第1天開(kāi)始進(jìn)行電針治療，連續(xù)治療6d為一個(gè)療程，療程間間隔1d，總共治療4個(gè)療程。③治療：術(shù)后第28天時(shí)取下電針組實(shí)驗(yàn)兔的造模器及克氏針后給予電針治療。操作者將實(shí)驗(yàn)兔予以固定后對(duì)兔L4-5雙側(cè)夾脊穴(參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位標(biāo)準(zhǔn)定位”)施以針刺治療(采用無(wú)菌1寸針灸針[5]，針刺深度為0.5～0.8cm)，通過(guò)捻轉(zhuǎn)手法操作至針下有沉澀感，并將針柄上連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，刺激參數(shù)選擇調(diào)頻波2/15Hz，強(qiáng)度1～2mA；每天行1次針刺治療，持續(xù)20min。見(jiàn)圖4。

圖1穿克氏針圖2上造模器圖3椎體間加壓

圖4 電針治療

1.3 觀察指標(biāo) 各組實(shí)驗(yàn)兔在術(shù)后第28天時(shí)間點(diǎn)各取出5只，拆除加壓裝置，拔出克氏針，行L4-5椎間盤(pán)平掃，之后處死并取出腰椎間盤(pán)組織；之后正常組、假模型組另外5只維持原來(lái)操作，模型組另外5只繼續(xù)加壓28d，電針組另外5只去除加壓裝置及克氏針后予以電針治療28d；術(shù)后第56天各組另5只實(shí)驗(yàn)兔再次行L4-5椎間盤(pán)平掃，之后處死并取出椎間盤(pán)組織；所有取出組織均通過(guò)Western blot檢測(cè)其中核心蛋白聚糖(decorin)的蛋白表達(dá)情況。首先根據(jù)蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，然后根據(jù)預(yù)染marker顯示，充分分離目的蛋白，取出凝膠用蒸餾水沖洗，接著剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。然后用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2h。再加入一抗孵育，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶40000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，顯色曝光。用Band-Scan凝圖像分析軟件分析膠片中decorin平均吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 磁共振檢測(cè)結(jié)果 達(dá)到28d造模周期后使用武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院Signa HDx 3.0T磁共振對(duì)實(shí)驗(yàn)兔行MRI檢查，攝取T2加權(quán)(矢狀位)圖像，結(jié)果顯示：正常椎間盤(pán)各節(jié)段表現(xiàn)為均勻明亮的高信號(hào)，見(jiàn)圖5；在造模器加壓28d后，椎間盤(pán)出現(xiàn)了黑色低信號(hào)(箭頭指示處)，與上下相鄰節(jié)段椎間盤(pán)信號(hào)相比有明顯差別，與正常椎間盤(pán)相比也有明顯差異，見(jiàn)圖6。表明成功建立了椎間盤(pán)退變的動(dòng)物模型。

圖5正常椎間盤(pán)圖6退變椎間盤(pán)

2.2 各組decorin表達(dá)結(jié)果 正常組、假模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)decorin蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組術(shù)后第28天、第56天及電針組術(shù)后第28天decorin含量與正常組及假模型組術(shù)后第28、56天相比明顯下降(均P<0.05)；模型組術(shù)后第56天較本組術(shù)后第28天decorin含量進(jìn)一步下降(P<0.05)；電針組術(shù)后第56天decorin含量與本組術(shù)后第28天時(shí)及模型組術(shù)后第56d天明顯上升(均P<0.05)。見(jiàn)圖7，表1。

A.正常組 B.假模型組 C.模型組 D.電針組

圖74組干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)decorin的Western blot膠片顯影結(jié)果

表1 4組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)decorin平均灰度值比較

與正常組及假模型組術(shù)后第28天比較，aP<0.05；與模型組術(shù)后第28天比較，bP<0.05；與電針組術(shù)后第28天及與模型組術(shù)后第56天比較，cP<0.05

3 討論

椎間盤(pán)主要由纖維環(huán)、髓核和上下椎體軟骨終板三部分組成。三者結(jié)構(gòu)上的特異性保證了椎間盤(pán)能夠維持脊柱的穩(wěn)定性，并且具有減震，合理分散脊柱軸向壓力的作用[6]。正常椎間盤(pán)屬于無(wú)血管組織，其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要依靠軟骨終板途徑，即椎體內(nèi)血管的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)骨髓腔-血竇-軟骨終板界面擴(kuò)散到椎間盤(pán)，營(yíng)養(yǎng)髓核與纖維環(huán)內(nèi)層[7]。隨著年齡的增長(zhǎng)椎間盤(pán)不可避免的出現(xiàn)生理性退變，髓核細(xì)胞數(shù)目相應(yīng)減少，其合成細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)量降低。此時(shí)若外加異常應(yīng)力長(zhǎng)期作用于椎間盤(pán)，一方面會(huì)使得軟骨終板出現(xiàn)形變、損傷、硬化、鈣化等病理性改變，繼而影響到椎間盤(pán)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)及代謝廢物的排除，從而導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的發(fā)生[8]；另一方面，會(huì)使得椎間盤(pán)內(nèi)相關(guān)炎癥因子增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解增強(qiáng)、合成減少，椎間盤(pán)張力下降，從而導(dǎo)致椎間盤(pán)退變[9]。Singh[10]指出，椎間盤(pán)退變主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的變化，且隨著椎間盤(pán)退變的發(fā)生，細(xì)胞外基質(zhì)中I型膠原、II型膠原、二聚糖、decorin等成分表達(dá)下調(diào)。decorin屬于蛋白多糖家族中的一種，亦稱為PGⅡ、PGS2及PG40。它是一種富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，通過(guò)核心蛋白與糖胺聚糖鏈相連[11]。由于其結(jié)構(gòu)較為特殊，因而具有一定的抗纖維化和抗腫瘤作用，并廣泛應(yīng)用于皮膚和腫瘤等領(lǐng)域[12]。然而decorin本質(zhì)屬于蛋白多糖，也具有維持椎間盤(pán)的正常代謝及應(yīng)力均勻分布的作用，故與椎間盤(pán)疾病也密切相關(guān)。研究者Risbud等[13]對(duì)Wistar大鼠椎間盤(pán)器官行整體培養(yǎng)，觀察髓核組織的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖、decorin內(nèi)等基質(zhì)成分在7d內(nèi)均有不同程度下降，而7d后基本趨于穩(wěn)定。進(jìn)一步證實(shí)了decorin與細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)系。因此，若能通過(guò)某種手段改變髓核內(nèi)蛋白多糖的含量，糾正基質(zhì)降解與合成的失衡，或許能對(duì)延緩椎間盤(pán)退變起到一定的益處[14]。

本實(shí)驗(yàn)參照參照國(guó)外研究者Kroeber等[4]的造模方法，在相鄰的椎體間進(jìn)行短期動(dòng)態(tài)加壓，通過(guò)刺激椎間盤(pán)基質(zhì)降解與合成的失衡從而誘發(fā)椎間盤(pán)退變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組術(shù)后第28d、第56d、電針組術(shù)后第28d decorin蛋白表達(dá)與正常組及假模型組術(shù)后第28d時(shí)相比均呈下降趨勢(shì)，可見(jiàn)軸向加壓作用于椎間盤(pán)可誘導(dǎo)腰椎間盤(pán)退變的發(fā)生，進(jìn)而影響到細(xì)胞外基質(zhì)的變化，導(dǎo)致decorin蛋白表達(dá)下調(diào)；模型組術(shù)后第56天decorin蛋白表達(dá)較本組術(shù)后第28天時(shí)進(jìn)一步下降，可見(jiàn)在椎間盤(pán)退變的基礎(chǔ)上，隨著軸向加壓時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞外基質(zhì)中的decorin會(huì)進(jìn)一步降解；而電針治療28d(即電針組術(shù)后第56天)decorin蛋白表達(dá)較本組術(shù)后第28d及模型組術(shù)后第56天反而上調(diào)了，可見(jiàn)電針促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)中decorin成分的增加。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)[15-16]：電針可上調(diào)模型兔退變腰椎間盤(pán)組織中Bcl-2蛋白表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，使細(xì)胞凋亡的敏感性降低、抗凋亡能力增強(qiáng)，引起細(xì)胞凋亡減少，繼而影響椎間盤(pán)基質(zhì)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，如上調(diào)合成代謝酶(骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2)、抗分解代謝酶(基質(zhì)金屬蛋白酶-1組織抑制因子)等的表達(dá)，下調(diào)分解代謝酶(基質(zhì)金屬蛋白酶-13)的表達(dá)，從而糾正基質(zhì)降解和合成代謝之間的失衡?；诖?，我們認(rèn)為電針可能通過(guò)提高椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)中decorin的含量，延緩了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，糾正了基質(zhì)降解與合成之間的失衡，繼而起到了延緩腰椎間盤(pán)退變的作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了電針治療腰椎間盤(pán)退變性疾病的可能機(jī)制，可以為臨床應(yīng)用電針?lè)乐窝甸g盤(pán)退行性疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但這個(gè)過(guò)程具體通過(guò)哪種信號(hào)通路介導(dǎo)的仍需進(jìn)一步深入研究。

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