基于GC-MS和主成分分析的蜂蠟質(zhì)量控制方法研究*

劉海洋，耿 放，尹麗穎，雷 霞*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江哈爾濱150025）

蜂蠟由工蜂蠟腺分泌，主要由酸類、游離脂肪酸、游離脂肪醇和碳水化合物組成。《神農(nóng)本草經(jīng)》首次將蜂蠟記載為藥物，其主下痢膿血，補(bǔ)中，續(xù)斷傷金瘡。1953年和1963年版藥典主要記錄了蜂蠟的來源、性狀、功能、用法和貯藏等，但沒有完整的蜂蠟質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。大量研究表明蜂蠟具有很高的藥理作用和應(yīng)用價(jià)值，但由于質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的不健全，蜂蠟質(zhì)量差別較大，導(dǎo)致臨床應(yīng)用效果不明顯。本文主要通過柱前衍生化氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，利用指紋圖譜對(duì)蜂蠟進(jìn)行鑒定分析，建立簡單快捷的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥物

蜂蠟樣品分為市場流通商品、蜂農(nóng)自制商品和本人自制樣品3 種，來源見表1。

蜂農(nóng)自制商品是直接從當(dāng)?shù)胤滢r(nóng)手中購得的蜂蠟；本人自制樣品是用從當(dāng)?shù)胤鋱霾少彽姆涑哺鶕?jù)2005年版藥典中方法加工而成。各蜂蠟樣品外觀差異較大，S2樣品蠟樣、顏色鮮艷，S6為黃色，S11樣品顏色最深，褐色中發(fā)黑。其中S2、S3有濃重的蠟味，而且質(zhì)地堅(jiān)硬，懷疑摻雜石蠟雜質(zhì)。帽兒山、寶清等自制蜂蠟有淡淡花香味，握之能夠軟化，質(zhì)地軟糯。

表1 蜂蠟樣品的來源情況Tab.1 Source of the beeswax sample

1.2 儀器

Agilent 6890N 氣相色譜儀和5975B 質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；CTC 自動(dòng)進(jìn)樣器及頂空裝置（瑞士CTC 股份有限公司）；Chemstation、AMDIS 軟件及NIST05 質(zhì)譜庫（安捷倫公司氣質(zhì)聯(lián)用自帶）。

2 方法及結(jié)果

2.1 樣品制備

取蜂蠟樣品約0.15g 左右用甲醇溶解定容在10mL 容量瓶中，取上述溶液4mL，加入2mL 甲醇及2mL 三氟化硼甲醇溶液，密封，在90℃烘箱中加熱1h，冷卻后加入蒸餾水0.5mL 振蕩30s，去除反應(yīng)后剩余的三氟化硼，混合溶液2500rpm 離心5min，移取有機(jī)相，取2mL 衍生化后溶液，加入2mL 醋酸酐，100μL 吡啶，密封，在90℃烘箱中加熱2h，冷卻至室溫，加入1M 的K2CO3溶液2mL，振蕩1min 除去未反應(yīng)完的醋酸酐，2500r·min-1離心5min。移取下層有機(jī)相為供試品溶液，進(jìn)樣1μL。

2.2 色譜條件

GC 條件：HP-5MS 柱（30m×0.25mm，0.25μm）；程序升溫，初始溫度100℃，以5℃·min-1升到300℃，保持10min；進(jìn)樣口溫度為280℃；載氣：高純He，分流比為20∶1，流速為1mL·min-1，進(jìn)樣量為1μL。

MS 條件：EI 離子源，電子能量70eV；離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃；自動(dòng)調(diào)諧；質(zhì)量掃描方式為全掃描；掃描范圍50～800aum；閾值30。

2.3 進(jìn)樣

取蜂蠟樣品約2g 置20mL 頂空瓶中，在80℃震蕩加熱30min，進(jìn)樣針加熱至80℃，抽取2mL 上層氣體，進(jìn)樣。

2.4 蜂蠟樣品定性分析

將2.1 項(xiàng)下制備樣品進(jìn)行GC-MS 分析，得到總離子流圖利用ChemStation 扣除背景后，自動(dòng)積分導(dǎo)出百分含量報(bào)告及譜庫（NIST 05a）檢索報(bào)告。對(duì)照以往文獻(xiàn)報(bào)道，確定蜂蠟中成分。

2.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，盡量消除可能的由于保留時(shí)間漂移及儀器測試時(shí)帶來的系統(tǒng)誤差對(duì)分類的影響，并使各變量幅度出于同一水平，有利于分類計(jì)算。

預(yù)處理步驟：（1）平移變換：采用局部最小二乘法；（2）數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：采用面積歸一化法；（3）數(shù)據(jù)中心化處理

本章所有算法源程序采用Matlab 7.0 編寫。

2.6 指紋圖譜研究（圖1）

圖1 a.不同來源蜂蠟樣品指紋圖譜；b.利用平均值建立共有模式；c.利用中位數(shù)建立共有模式Fig.1 a.Fingerprint samples with different sources of beeswax，the mutual model was established based on average；b.and median；c.value

2.6.1 指紋圖譜初步分類 圖1a 為柱前衍生化后14 個(gè)樣品指紋圖譜，直觀觀察圖譜發(fā)現(xiàn)大部分蜂蠟樣品成分基本相似，經(jīng)鑒定共有色譜峰為十六烷酸甲酯、十八烷酸甲酯、二十七烷烴、二十四烷酸甲酯、乙酸三十烷酯、二十九烷烴、乙酸三十二酯、雙烯三十三烷烴、三十四烷醇等，其中十六烷酸甲酯及十八烷酸甲酯占據(jù)了整個(gè)譜峰峰面積的絕大部分。取校正后的14 個(gè)樣本色譜指紋圖譜的中位數(shù)作為此批樣本的對(duì)照譜進(jìn)行相似性分析，結(jié)果見表2，得出樣本大體上可以將其分為兩大類，即S1、S2、S3樣品歸為一類，而其余11 個(gè)樣品歸為另一類。

表2 不同來源蜂蠟樣品相似度分析Tab.2 Similarity analysis of beeswax sample from different sources

2.6.2 指紋圖譜共有模式建立 剔除S1、S2、S3這三個(gè)與主體成分差異較大的譜圖，利用取中位值法和取中位數(shù)法建立蜂蠟11 個(gè)樣品的指紋圖譜，見圖1b、c。

分別計(jì)算樣品與14 個(gè)共有模式的相關(guān)系數(shù)及11 個(gè)樣品的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

由表2 該結(jié)果可知，選取11 個(gè)主體色譜峰的相關(guān)系數(shù)差異增加，說明該選取方法科學(xué)合理，能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速分類。

2.7 主成分分析（圖2）

圖2 投影圖Fig.2 a.Beeswax sample score matrix projection drawing；b.Load matrix 3D projection；c.Principal component analysis 2D projection

2.7.1 樣品測定及數(shù)據(jù)預(yù)處理 根據(jù)2.1 項(xiàng)下制備S1-S14 樣品，在2.2 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，得到總離子流圖。所得總離子流圖在ChemStation 扣除背景后自動(dòng)積分導(dǎo)出百分含量報(bào)告，將各樣品中大于0.1%色譜峰峰面積，按照保留時(shí)間將所有樣品相對(duì)峰面積列出，沒有的色譜峰相對(duì)峰面積為0。將樣本矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除由于數(shù)據(jù)變換的幅度、范圍及數(shù)據(jù)分布的非正態(tài)性對(duì)分析結(jié)果的影響。

2.7.2 主成分分析結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)化后的樣本矩陣進(jìn)行主成分分析，分別去樣本矩陣中得分矩陣的第1主成分、第2 主成分、第3 主成分做圖，得到投影圖2a，由圖可知，14 個(gè)蜂蠟樣品大體可分為2 類，一類是S1、S2、S3 樣品偏離主體，其余11 個(gè)樣品在主體范圍內(nèi)，離散樣品指紋圖譜與其他樣品差異較大，驗(yàn)證了上述指紋圖譜分類的結(jié)論。從外觀上看，離散樣品質(zhì)地硬，似蠟狀，外觀形狀較差，疑似摻雜石蠟所致。將樣本矩陣的載荷矩陣中的第1 主成分、第2 主成分、第3 主成分做圖，得到投影圖2b，將載荷矩陣中的第1 主成分、第2 主成分做圖，投影得到圖2c，結(jié)合兩圖可看出造成樣品質(zhì)量不均一，產(chǎn)生差異的原因可能是由于2、6、9、10、14、17、21、22、24、29、33、37、38、44 等化合物造成。化合物經(jīng)譜庫檢索后得到結(jié)果見表3。

表3 引起蜂蠟樣品質(zhì)量差異的可能化合物Tab.3 The possible compounds of the quality differences between beeswax sample

引起質(zhì)量差異最明顯原因就是6 號(hào)化合物-十六烷酸以及38 號(hào)化合物乙酰三十烷酯，這兩種化合物也是前期報(bào)道[1]中蜂蠟主要成分。

3 結(jié)論

隨著有機(jī)除螨劑及農(nóng)藥的大量應(yīng)用，嚴(yán)重影響人們的身體健康，完善的蜂蠟質(zhì)量評(píng)價(jià)體系越來越受到學(xué)者們的關(guān)注,所以有學(xué)者[2]認(rèn)為影響蜂蠟質(zhì)量的最主要因素是在蜂巢中應(yīng)用的各種除螨劑，大量的學(xué)者也研究了對(duì)于這些物質(zhì)的殘留檢測方法[3，4]。

趙天波等[5]提出根據(jù)硬脂酸和石蠟在濃H2SO4中的可炭化率比較低，測定蜂蠟中物質(zhì)的炭化率，從而大體確定蜂蠟中的摻假物質(zhì)的多少。盧煥福[6]采集全國10 個(gè)產(chǎn)地的蜂蠟，通過中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-蜂蠟SB/T10190-93 進(jìn)行鑒定，表明均合格，系正品。利用GC-FID 進(jìn)行指紋圖譜研究，找到17 個(gè)共有峰。有學(xué)者通過GC 色譜儀測定蜂蠟中的總酸類、總醇類[7]以及碳?xì)浠衔锖蛦沃怺8]成分。Tulloch A P 通過測定蜂蠟中的主要成分w長鏈酯類以及烷烴類，以及皂化后濁點(diǎn)的測定，來判斷蜂蠟樣品中摻假物的多少。因蜂蠟地域差異性很大，單從化學(xué)成分分析，很難建立適用性廣泛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所以學(xué)者提出從理化性質(zhì)角度建立。Bernal J L 等[9]研究眾多的樣品確定蜂蠟的基本的理化性質(zhì)范圍，通過測定摻入不同比例摻假物的理化性質(zhì)中的熔點(diǎn)、酸值、碘值、酯化值、過氧化值等范圍以判斷蜂蠟樣品中含有摻假物質(zhì)的多少。

本實(shí)驗(yàn)是分析14 個(gè)樣品的指紋圖譜之后發(fā)現(xiàn)，S1、S2、S3樣品指紋圖譜差異大，主要表現(xiàn)在烷烴類成分。除S1、S2、S3樣品的相關(guān)系數(shù)小于0.70 外，其余樣品相關(guān)系數(shù)均大于0.82。故大體上可以將其分為兩大類，即S1、S2、S3樣品歸為一類，而其余11個(gè)樣品歸為另一類。利用主成分分析對(duì)指紋圖譜的簡單分類結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

通過主成分分析，將樣品S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14進(jìn)行區(qū)分，得出引起樣品質(zhì)量差異的原因可能是由化合物2、6、9、14、17、21、22、24、29、33、37、39、44 等造成。雖然以往報(bào)道蜂蠟中的主要藥效成分為烷醇類，筆者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行衍生化條件不能充分測定該類成分，所以在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的過程中筆者不建議直接測定該類成分，由于大多數(shù)的烷醇類與烷酸類形成酯類，可以通過測定烷酸類含量反映烷醇類成分含量。

引起蜂蠟質(zhì)量不均一的原因是由于摻入石蠟等樣品造成烷烴類種類增多、含量過高；這樣相對(duì)于烷烴類烷酸、烷醇類成分相對(duì)較低，蜂蠟中摻假也會(huì)有十六烷酸、十八烷酸等，但不會(huì)影響結(jié)合烷酸類含量。所以建立蜂蠟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該選擇測定總烷酸類含量同時(shí)限制烷烴及游離烷酸含量。

［1］Jimenez J J,Bernal J L,Aumente S,et al. Quality assurance of commercial beeswax II. Gas chromatography-electron impact ionization mass spectrometry of alcohols and acids［J］.J Chromatogr A,2003,1007（1-2）:101-116.

［2］Menendez R,Mas R,Illnait J,et al. Effects of D-002 on Lipid Peroxidation in Older Subjects.［J］.J Med Food,2001,4（2）:71-77.

［3］Frison S,Breitkreitz W,Currie R,et al. The analysis of fluvalinate in beeswax using GC/MS［J］. Food Research International,1999,32（1）:35-41.

［4］Jimenez J J,Bernal J L,Del N M,et al. Liquid-liquid extraction followed by solid-phase extraction for the determination of lipophilic pesticides in beeswax by gas chromatography-electroncapture detection and matrix-matched calibration.［J］. Journal of Chromatography A,2004,1048（1）:89-97.

［5］趙天波,李鳳艷.蜂蠟純度分析及摻雜物的鑒定:可炭化物測定方法的改進(jìn)［J］.精細(xì)化工,1998,15（005）:39-42.

［6］盧煥福.蜂蠟氣相指紋圖譜的研究［D］.大連:大連醫(yī)科大學(xué),2008.

［7］Jimenez J J,Bernal J L,Aumente S,et al. Quality assurance of commercial beeswax II. Gas chromatography-electron impact ionization mass spectrometry of alcohols and acids［J］.J Chromatogr A,2003,1007（1-2）:101-116.

［8］Jimenez J J,Bernal J L,Aumente S,et al. Quality assurance of commercial beeswax. Part I. Gas chromatography-electron impact ionization mass spectrometry of hydrocarbons and monoesters［J］.J Chromatogr A,2004,1024（1-2）:147-154.

［9］Bernal J L,Jiménez J J,Del Nozal M J,et al. Physico-chemical parameters for the characterization of pure beeswax and detection of adulterations［J］.European JournalofLipid Scienceand Technology,2005,107（3）:158-166.