小分子團磁化水對蕓豆清蛋白浸出效果的影響

包國鳳，刁靜靜，井雪蓮，張麗萍

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心）

蕓豆學名菜豆，是普通菜豆和多花菜豆之總稱，屬豆科菜豆屬的小宗雜糧作物[1]。其營養(yǎng)豐富，據(jù)測定，每百克菜豆含蛋白質(zhì)23.1克、脂肪1.3克、碳水化合物56.9克，蛋白質(zhì)含量高于雞肉[2]，因此蕓豆蛋白質(zhì)可作為食品中的營養(yǎng)添加劑。植物蛋白中營養(yǎng)價值最高的是清蛋白，其氨基酸種類多，同時具有良好的溶解性、起泡性和乳化性等功能特性[3]。傳統(tǒng)食品加工中主要利用動物蛋白如雞蛋、牛乳等提高蛋糕、面包和冰淇淋等食品的品質(zhì)[4]。然而，動物蛋白價格高，且資源有限，因此，開發(fā)植物優(yōu)質(zhì)蛋白具有重要的現(xiàn)實意義。

蕓豆清蛋白富含谷氨酸、亮氨酸、天門冬氨酸等，具有極高的營養(yǎng)價值和功能價值[5]。如果將蕓豆清蛋白分離出來，可用于香腸、面包、冰淇淋等食品中，將會為蛋白源提供極好的補充。目前堿溶酸沉法提取的蕓豆蛋白是總蛋白，其中包含了清蛋白組分。如果采用水浸提法可將蕓豆中的清蛋白分離提取出來，通常采用的水浸提法是用自來水或純凈水。目前有報道使用小分子團磁化水提取動植物多糖的研究，水在磁場中以一定速度沿垂直磁力線方向流動并被磁化，其表面張力系數(shù)、黏度、密度、電導率、pH值等均發(fā)生變化，因此具有較強的穿透細胞、代謝物質(zhì)的能力[6]。由于小分子團磁化水進出細胞能力強，使得提取的物質(zhì)溶出量大，具有提高提取率的特點，因此，針對的小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白的工藝參數(shù)進行試驗，為高效提取蕓豆清蛋白提供技術參考。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

蕓豆（墾蕓2號），市售；低分子量蛋白Marker，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；

硫酸銅，硫酸鉀，濃硫酸，氫氧化鈉，硼酸，鹽酸，甲基紅，亞甲基藍，自來水，純凈水，冰乙酸，氯化鈉，Tris，Bis，SDS，巰基乙醇，溴酚藍，考馬斯亮藍，甲醇，以上均為市售分析純；小分子團磁化水，自制。

1.2 儀器設備

SKDA-800型自動凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；Coolsafe TM 55 110-4L/55-9L冷凍干燥機：環(huán)球分析測試儀器有限公司；LD4-40型低速大容量離心機：北京京立離心機有限公司；STS-2A型水平脫色搖床：上海琪特分析儀器有限公司；Mini Protean3Cell型垂直電泳電泳槽，Powerpac Universal電泳儀：BIO-RAD美國伯樂；Gel-Pro Imager Kit型電泳凝膠成像系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司。

2 試驗方法

2.1 蕓豆清蛋白提取的工藝路線

2.2 工藝操作要點

2.2.1 蕓豆粉碎

挑選干凈、除雜后的墾蕓2號蕓豆，利用高速粉碎機粉碎。

2.2.2 過篩

取粉碎后的蕓豆干粉過不同孔徑篩網(wǎng)。

2.2.3 浸提

取過篩后的蕓豆干粉10 g放置于燒杯中，按一定液料比加入提取液，在一定溫度、一定時間下均勻攪拌。

2.2.4 離心

將浸提液3 200 rpm離心15 min，將上清液用200目濾布過濾除雜。

2.2.5 等電點沉淀

將0.1 mol·L-1鹽酸緩緩加入到上清液中，調(diào)pH至4.5，靜置2 h，待明顯分層后離心，再用氫氧化鈉將離心底物調(diào)至中性。

2.2.6 冷凍干燥制粉

利用冷凍干燥設備將酸沉離心后的沉淀冷凍干燥制粉，測定蛋白質(zhì)含量，計算提取率。

2.3 蕓豆清蛋白含量的測定與提取率的計算

采用GB 5009.5-2010凱氏定氮法測定提取物中蕓豆清蛋白含量，稱量利用恒溫干燥箱干燥后的蕓豆清蛋白提取物，計算蕓豆清蛋白提取率。每組試驗設三個平行樣，取平均值，計算方法如下：

2.4 單因素試驗

用小分子團磁化水、自來水和純凈水為蛋白提取溶劑，選擇提取時間、提取溫度、液料比和粉碎粒度為影響清蛋白提取率的影響因子，研究不同因素對清蛋白提取率的影響效果。

2.4.1 不同處理水在不同提取溫度下的蕓豆清蛋白提取率試驗

設提取溫度分別為25、30、35、40和45℃，其他條件不變，采用2.2工藝及參數(shù)，以2.3為指標計算不同處理水在不同提取溫度下的蕓豆清蛋白提取率。

2.4.2 不同處理水在不同提取時間下的蕓豆清蛋白提取率試驗

設提取時間分別為1、1.5、2、2.5和3 h，其他條件不變，采用2.2工藝及參數(shù)，以2.3為指標計算不同處理水在不同提取溫度下的蕓豆清蛋白提取率。

2.4.3 不同處理水在不同液料比時的蕓豆清蛋白提取率試驗

設液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，其他條件不變，采用2.2工藝及參數(shù)，以2.3為指標計算不同處理水在不同提取溫度下的蕓豆清蛋白提取率。

2.4.4 不同處理水在不同粉碎粒度時的蕓豆清蛋白提取率試驗

設粉碎粒度分別為20、40、60、80和100目，其他條件不變，采用2.2工藝及參數(shù)，以2.3為指標計算不同處理水在不同提取溫度下的蕓豆清蛋白提取率。

2.5 蕓豆清蛋白提取技術參數(shù)優(yōu)化試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選取其中提取率最高的一種溶劑作為技術參數(shù)優(yōu)化的試驗數(shù)據(jù)，設其提取溫度（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）、粉碎粒度（X4）為自變量，以蕓豆蛋白提取率為因變量，采用Design-Expert.V8.0軟件設計三因素五水平回歸組合試驗實驗設計見表1。

表1 試驗設計的因素和水平編碼表Table 1 Factors of test design and level of coding TAB

2.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗平行重復3次，取平均值，采用Design-Expert.V8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.7 蕓豆清蛋白電泳表征

采用NY/T1663-2008行業(yè)標準聚丙烯酰胺凝膠電泳法，取蕓豆清蛋白粉加尿素溶解，添加溴酚藍煮沸2～3 min后，取20 μL點樣，采用5%的濃縮膠和12%分離膠進行垂直電泳，條件為80 V、15 A，電泳至濃縮膠與分離膠臨界線，再調(diào)至120 V、30 A，電泳至染色液最底處，電泳后用0.1%W·V-1考馬斯亮藍R250在搖床作用下染色三小時，最后用乙醇冰乙酸脫色，每兩小時換一次脫色液，直至背景透明，最后利用電泳凝膠成像系統(tǒng)成像，計算蕓豆清蛋白分子量。

以每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標準曲線，量出未知蛋白遷移率，計算蛋白分子量。

3 結果與分析

3.1 不同處理水在不同提取溫度下對蕓豆清蛋白提取率的影響

圖1是提取時間2 h、液料比20∶1、粉碎粒度60目時，不同處理水在不同提取溫度下的蕓豆清蛋白提取率。

圖1 不同處理水在不同提取溫度下對蕓豆清蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different temperature

由圖1結果可知，當提取溫度為30℃時，小分子團磁化水、自來水與純凈水提取蕓豆清蛋白的提取均率最高，但其中小分子團磁化水的提取率最高。35℃后開始下降，差異性分析表明，提取溫度為30℃與35℃的兩個處理量提取率差異顯著（P＜0.05），因此30℃較為合適[7]。

3.2 不同處理水在不同提取時間下對蕓豆清蛋白提取率的影響

圖2是提取溫度30℃、液料比20∶1、粉碎粒度60目時，不同處理水在不同提取時間下的蕓豆清蛋白提取率。

圖2 不同處理水在不同提取時間下對蕓豆清蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different time

由圖2結果可知，當提取時間為2 h時，小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白的提取率最高，2.5 h后開始下降。這與周大寨的研究結果相同[8]，即提取蕓豆蛋白的過程中，由于提取時間過長，蕓豆中的酶類也漸漸溶出，起到了水解蛋白的作用，從而導致蕓豆清蛋白的水解，蕓豆清蛋白的含量漸漸降低，計算的提取率的也出現(xiàn)降低現(xiàn)象。

3.3 不同處理水在不同液料比下對蕓豆清蛋白提取率的影響

圖3是提取溫度30℃、提取時間2 h、粉碎粒度60目時，不同處理水在不同液料比下的蕓豆清蛋白提取率。

圖3 不同處理水在不同液料比下對蕓豆清蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different solid-liquid rate

由圖3結果可知，隨著液料比的增大蕓豆清蛋白的提取率逐漸升高，當液料比為20∶1時，蕓豆清蛋白的提取率呈增長趨勢不明顯，造成這種狀況的原因是液料比較小時，水分不足，蕓豆粉不能完全溶于水中，物料分散不均勻，使得清蛋白沒有完全溶出。當液料比達到20∶1時，處理水充足，蕓豆粉能夠完全溶于水中。差異性分析表明，液料比20∶1與25∶1兩個處理量差異不顯著（P＞0.05），且液料比越高生產(chǎn)成本也越大，過大的液料比會降低蛋白質(zhì)提取液濃度，延長后續(xù)操作時間，綜合考慮液料比為20∶1較為合適。

3.4 不同處理水在不同粉碎粒度下對蕓豆清蛋白提取率的影響

圖4是提取溫度30℃、提取時間2 h、液料比20∶1時，不同處理水在不同粉碎粒度下的蕓豆清蛋白提取率。

圖4 不同處理水在不同粉碎粒度下對蕓豆清蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different crushing fineness

由圖4結果可知，隨著粉碎粒度的減小蕓豆清蛋白的提取率逐漸升高，當粉碎粒度為60目以上時，蕓豆清蛋白的提取率呈增長趨勢不明顯。差異性分析表明，粉碎粒度60目與80目兩個處理量差異不顯著（P＞0.05），故選取粉碎粒度為60目較合適。

由以上四個單因素試驗分別可以看出，提取溫度、提取時間、液料比、粉碎粒度四個因素對蕓豆清蛋白提取率都有很大的影響，從圖1～4均可以看出小分子團磁化水作為處理水提取蕓豆清蛋白有效的提高了清蛋白的提取率，這是因為水經(jīng)過磁化處理后，由于水分子之間的氫鍵斷裂，形成小分子團水，具有滲透力強，溶解力強的特點，能增加水的生物膜透過率，能夠?qū)⒏嗟牡鞍兹芙獬鰜韀9-10]，因此大大提高了清蛋白的提取率。

3.5 小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白的工藝參數(shù)優(yōu)化結果

3.5.1 試驗模型的建立與分析

根據(jù)上述的單因素實驗結果，采用四因素五水平二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合法，利用Design-Expert.V8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合。分析提取溫度、提取時間、液料比和粉碎粒度對蕓豆清蛋白提取率的影響，見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments

續(xù)表2 響應面試驗設計及結果

通過軟件對表的實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到提取溫度（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）和粉碎粒度（X4）對蕓豆清蛋白提取率（Y）二次多項回歸模型方程：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可以看出，模型的F1=39.18，P＜0.000 1，表明模型方程極顯著，不同處理間的差異極顯著；失擬項P=0.175 7＞0.05，差異不顯著；模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.938 5，說明該模型能解釋約93.85%響應值的變化，表明方程擬合程度良好，實驗誤差小，可以用來分析和預測蕓豆清蛋白的提取率。四個一次項F值大小依次為X1＞X2＞X3＞X4，說明提取溫度對蕓豆清蛋白的提取率影響最大，提取時間和液料比次之，粉碎粒度對蕓豆清蛋白提取率的影響最小。

利用響應面法優(yōu)化技術參數(shù)，可以在單因素的基礎上，有效的通過軟件擬合，找出最佳的技術參數(shù)，從而得到最優(yōu)結果。

3.5.2 單因素效應分析

采用降維方法，將其他四因子固定在0編碼水平，分別描述單個因素變動對蕓豆清蛋白提取率的影響。

提取溫度（X1），提取時間（X2），液料比（X3），粉碎粒度（X4）的單因素效應方程為：

根據(jù)此方程，分別得到提取溫度（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）、粉碎粒度（X4）的單因子效應曲線如圖5所示。

圖5 蕓豆清蛋白提取率分析值單因子效應曲線Fig.5 Single factor curve of analysis value on albumin extraction yield of kidney bean

由圖5可以看出，在實驗范圍內(nèi)蕓豆清蛋白提取率值隨著四個因素的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

將單因子方程對其本身求一階偏導數(shù)，得到單因子的邊際效應方程。單因子的邊際效應反映Y值隨各因子投入水平而變化的速率。

提取溫度（X1）、提取時間（X2）、液料比（X3）、粉碎粒度（X4）的單因子邊際效應方程為：

圖6 蕓豆清蛋白提取率分析值單因子邊際效應曲線Fig.6 Single factor marginal curve of analysis value on albumin extraction yield of kidney bean

從圖6可以看出，提取溫度（X1）在編碼0.45之前對蕓豆清蛋白提取率的影響為正效應，0.45編碼之后對蕓豆清蛋白提取率的影響負效應；提取時間（X2）在0.48之前對蕓豆清蛋白提取率的影響為正效應，0.48編碼之后對蕓豆清蛋白提取率的影響為負效應；液料比（X3）在0.34之前對蕓豆清蛋白提取率的影響為正效應，0.34編碼之后對蕓豆清蛋白提取率的影響為負效應；粉碎粒度（X4）在0.22之前對蕓豆清蛋白提取率的影響為正效應，0.22編碼之后對蕓豆清蛋白提取率的影響為負效應，以提取溫度影響最大，提取時間和液料比的影響次之，粉碎粒度的影響最小。

3.5.3 雙因素效應分析

為了得到某兩個因素同時對清蛋白提取率的影響，采用降維分析方法，觀察在其他因素條件固定不變情況下，某兩個因素對清蛋白提取率的影響，即提取溫度（X1）與粉碎粒度（X4）交互作用及提取溫度（X1）與提取時間（X2）交互作用對清蛋白提取率的影響顯著。圖7和圖8是根據(jù)多元回歸方程作出的等高線圖及響應曲面，對這些因素中交互項之間的交互效應進行分析。

圖7 Y=f（X1，X4）的響應面圖等高線圖及其響應曲面圖Fig.7 Responsive contour plot and surfaces of Y=f（X1，X4）

由X1與X4的交互圖可以看出，當提取溫度（X1）與粉碎粒度（X4）處于高編碼值時，二者交互作用顯著，Y值處于較高水平；隨著提取溫度（X1）與粉碎粒度（X4）編碼值的增加，響應值逐漸增大；但當響應值增大到某極值后，隨著自變量的增大響應值有減小的趨勢。

圖8 Y=f（X1，X2）的響應面圖等高線圖及其響應曲面圖Fig.8 Responsive contour plot and surfaces of Y=f（X1，X2）

由提取溫度（X1）與提取時間（X2）的交互圖可以看出，當提取溫度（X1）與提取時間（X2）處于高編碼值時，二者交互作用顯著，Y值處于較高水平；隨著提取溫度（X1）與提取時間（X2）編碼值的增加，響應值逐漸增大；但當響應值增大到某極值后，隨著自變量的增大響應值有減小的趨勢。

由圖7和圖8可以看出，等高線均呈橢圓，表示提取溫度（X1）與粉碎粒度（X4）及提取溫度（X1）與提取時間（X2）之間的交互作用對蕓豆清蛋白提取率都有一定的影響，響應曲面圖均開口向下、凹面，表明響應值的大小隨著自變量的大小而改變，而且增減幅度也不一樣。隨著各個自變量的增大，響應值逐漸增大，但當響應值增大到某極值后，隨著自變量的增大，響應值有減小的趨勢。由圖可知該模型的試驗范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點是最大值。

3.5.4 響應面優(yōu)化結果與技術參數(shù)驗證

通過Design-Expert.V8.0軟件優(yōu)化得出小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白提取率的最佳工藝參數(shù)為：提取溫度31℃、提取時間2 h、液料比22∶1、粉碎粒度60目，并得出最大清蛋白提取率49.21%。對該技術參數(shù)結果進行3次驗證實驗，結果得出小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白提取率為48.96%，實驗值與模型的理論值非常接近，且重復實驗相對偏差不超過1%，說明重現(xiàn)性良好，故該模型合理，優(yōu)化結果可行。

圖9 蕓豆清蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.9 SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis of kidney bean albumin

圖10 蕓豆清蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量對數(shù)與相對遷移率曲線圖Fig.10 Molecular weight and relative mobility logarithmic on SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis graph of kidney bean albumin

3.6 蕓豆清蛋白SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖9是對試驗中提取的蕓豆清蛋白進行的SDS-PAGE凝膠電泳表征。該電泳圖上有5條明顯譜帶，將蛋白Marker分子量的對數(shù)與相對遷移率作標準曲線（圖10），求得分子量對數(shù)與相對遷移率關系式為：y=-1.208 8x+5.366 4，R2=0.995 3

R2為0.995 3，說明分子量對數(shù)與相對遷移率的相關性強。將蕓豆清蛋白條帶相對遷移率帶入公式，得到清蛋白分子量對數(shù)，進而求得蕓豆清蛋白分子量。圖中分別呈現(xiàn)1、3 mg·mL-1和5 mg·mL-1三個不同濃度的清蛋白電泳圖譜，可看出，在不同濃度添加量下，蕓豆清蛋白主要在42.01 kDa分子量聚集，該亞基分子組成居多。賈俊強在2009年研究了脫脂小麥胚芽蛋白分類及其氨基酸組成分析，利用SDSPAGE凝膠電泳測得小麥胚芽清蛋白亞基分子量范圍主要在38.2～52.48 kDa[11-12]；崔竹梅在2007年研究了鷹嘴豆籽粒清蛋白和球蛋白等電點、相對分子量的測定，利用SDS-PAGE凝膠電泳測得鷹嘴豆清蛋白亞基相對分子量范圍為35～62 kDa[13]；李永武在2014年研究了綠豆清蛋白的提取及其功能特性和理化性質(zhì)研究，利用SDS-PAGE凝膠電泳測得綠豆清蛋白亞基蛋白分子量多數(shù)在48.99 kDa范圍內(nèi)[14]。前人的研究結果說明清蛋白的分子量基本在30～60 kDa范圍內(nèi)，而本實驗通過SDS-PAGE凝膠電泳分析所得到的蕓豆清蛋白分子量為42.01 kDa，與前人測得的清蛋白分子量相符，說明實驗所得蛋白產(chǎn)品是清蛋白。

4 結論

通過對小分子團磁化水、自來水和純凈水作提取蕓豆清蛋白的試驗，得出在不同提取溫度、不同提取時間、不同液料比和不同粉碎粒度四個因素下的最佳提取效果，當提取溫度30℃，提取時間2 h，液料比20∶1，粉碎粒度60目時蕓豆清蛋白的提取率均最高，其中小分子團磁化水組提取率為48.87%，高于自來水組（42.79%）和純凈水組（40.87%）；通過對小分子團磁化水提取的蕓豆清蛋白進行SDS-PAGE電泳測試，發(fā)現(xiàn)其分子量排布主要集中在42.01 kDa左右，這與賈俊強、崔竹梅、李永武等人測定的清蛋白分子量相符，說明所提取的蛋白為清蛋白。

實驗中通過Design-Expert.V8.0軟件中心組合試驗設計，對小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白的工藝關鍵參數(shù)進行了優(yōu)化，最終確定提取溫度31℃、提取時間2 h、液料比22∶1，粉碎粒度60目。其理論值為49.21%，驗證試驗后，清蛋白提取率達到了48.96%。實驗證明，利用小分子團磁化水提取蕓豆清蛋白有效的提高了清蛋白的提取率。

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