大慶屠宰牛肉中沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

徐昊，孫海英，翟軍軍，薛洋洋，徐劍華，任超，穆昱，楊玉英

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

沙門氏菌是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一[1]，其病原沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動物的繁殖生產(chǎn)力。沙門氏菌菌型繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前已確認(rèn)的沙門氏菌有2 535個血清型，中國已檢出292個血清型[2]。絕大多數(shù)沙門氏菌對人和動物具有致病性，能引起人和動物多種不同的沙門氏菌病，是引起人類食物中毒的常見病原菌。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首[3-4]。近年來，沙門氏菌大規(guī)模污染食品并引起食物中毒的事件時有發(fā)生[5-6]。動物性食品是沙門氏菌污染的主要對象，動物生前以及后續(xù)的屠宰加工、運輸、貯藏和銷售等環(huán)節(jié)都容易污染和傳播沙門氏菌。此外，沙門氏菌在人和動物中具有廣泛的宿主，很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑進(jìn)行傳播[7]。牛肉是我國廣大居民的主要動物性食品之一，實時監(jiān)測牛肉產(chǎn)業(yè)鏈（包括養(yǎng)殖場、屠宰場和銷售市場）中沙門氏菌的污染和傳播情況對確保牛肉安全具有重要意義。研究旨在了解大慶市部分地區(qū)牛源沙門氏菌污染情況，分析其分布與傳播，為牛肉生產(chǎn)安全和沙門氏菌食物中毒的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇大慶市5個農(nóng)貿(mào)市場即新村區(qū)、大同區(qū)、紅崗區(qū)、薩爾圖區(qū)、龍鳳區(qū)，于清晨6時采樣。購買的牛肉樣品立即裝入無菌瓶中，再裝于無菌的塑料袋密封保存。在塑料袋上做好相應(yīng)的標(biāo)記。

1.2 主要培養(yǎng)基

血液培養(yǎng)基，SS培養(yǎng)基，HE培養(yǎng)基。

1.3 主要試劑儀器

沙門氏菌生化鑒定管（批號：071128）和藥敏試紙片（批號：20060511），杭州天和微生物試劑有限公司；康為世紀(jì)生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；高速冷凍離心機(jī)，Kendro laboratory公司；DRP-9272型熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；美國Bio-rad C1000 Touch PCR儀，美國Bio-rad公司；標(biāo)準(zhǔn)型雙人凈化工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將從五個地區(qū)采的樣品做好記錄，把每個肉樣的表面和深部組織涂布于血平板上，于溫度37℃恒溫箱培養(yǎng)16～24 h。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及染色鏡檢

挑取血平板上培養(yǎng)16 h以上的新鮮菌落，進(jìn)行形態(tài)觀察，選取規(guī)則的可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。鏡檢后選擇可疑菌落進(jìn)行傳代純培養(yǎng)，接種在SS培養(yǎng)基和HE培養(yǎng)基上。溫度37℃恒溫箱培養(yǎng)16～24 h，觀察SS培養(yǎng)基和HE培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。

2.3 細(xì)菌的生化試驗

將需要鑒別的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種在乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、苯丙氨酸、丙二酸鹽、硫化氫、靛基質(zhì)、甲基紅、枸櫞酸鹽、尿素等生化試劑管內(nèi)，于37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，并設(shè)置對照組，相同條件下培養(yǎng)。

2.4 PCR鑒定

2.4.1 細(xì)菌DNA的提取

將純培養(yǎng)的沙門氏菌疑似株接種到5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃震蕩過夜。按照康為世紀(jì)生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的方法，提取細(xì)菌的DNA作為PCR反應(yīng)模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 引物的設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]針對沙門氏菌invA毒素的基因序列，選擇保守性區(qū)域用primer 5.0軟件設(shè)計沙門氏菌invA的特異性引物。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物為5’-CTT TGG TCG TAA AAT AAG GCG-3’；

下游引物為5’-TGC CCA AAG CAG AGA GAT TCT-3’。

2.4.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×Taq Reaction Buffer（Mg2+Plus）3.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.25 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O17.75 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。于4℃保存。

2.4.4 PCR產(chǎn)物的電泳

取PCR產(chǎn)物加在 1%的瓊脂糖凝膠（含0.5 μg·mL-1溴化乙錠）上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍照留圖并分析結(jié)果。

2.5 藥敏試驗

取100 μL沙門氏菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，再用無菌鑷子取各種藥敏片輕輕放于表面，37℃培養(yǎng)18～24 h。測量各藥敏紙片抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果判斷按照NCCLS2012年標(biāo)準(zhǔn)，作出判斷。

3 結(jié)果

3.1 鑒別培養(yǎng)及染色鏡檢的結(jié)果

肉樣深部組織涂板未見菌落長出，而表面涂板有菌落生長。在營養(yǎng)瓊脂平板上生長2 mm左右的光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落。SS瓊脂上生長帶有黑點的小菌落。染色、鏡檢發(fā)現(xiàn)所檢測細(xì)菌呈革蘭氏陰性、兩端頓圓的短桿菌。

3.2 生化鑒定結(jié)果

瓊脂平板分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇等；不發(fā)酵乳糖、蔗糖等；能利用枸櫞酸鹽；靛基質(zhì)試驗為陰性；硫化氫、苯丙氨酸為陽性（見表1）。

表1 沙門氏菌生化反應(yīng)鑒定Table 1 Biochemical identification of Salmonella

3.3 PCR鑒定結(jié)果

圖1為沙門氏菌invA基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從樣品中擴(kuò)增出大小為234 bp目的片段。

3.4 藥敏試驗結(jié)果

沙門氏菌對14種抗微生物藥的耐藥情況各不相同。對阿米卡星和氯丙嗪的最敏感。而對卡那霉素和依諾沙星也有較高的敏感度。此外，對青霉素G耐藥性最高，對萬古霉素、四環(huán)素和多粘菌素不敏感。各種藥物敏感性見表2。

圖1 沙門氏菌PCR擴(kuò)增

表2 沙門氏菌對14種藥物的敏感性試驗Table 2 Sensitivity test of Salmonella to 14 kinds of drugs

4 討論

研究檢測沙門氏菌采用傳統(tǒng)方法分離，PCR鑒定，快速而準(zhǔn)確的檢測出樣品中的沙門氏菌。從采集的31份樣品中分離出一株沙門氏菌，檢出率為3.2%。沙門氏菌是引起人類食物中毒的常見病原菌，它的研究在獸醫(yī)與公共衛(wèi)生上有十分重要的意義。實驗中分離得到的沙門氏菌對阿米卡星、卡那霉素和氯丙嗪有較高的敏感性；對多粘菌素和青霉素G耐藥性最高；對氨芐西林和紅霉素有不同程度的耐藥性；對四環(huán)素、萬古霉素和復(fù)方新的明不敏感。由藥敏試驗結(jié)果顯示沙門氏菌對抗生素的耐藥性已普遍存在，這與抗生素的濫用有直接關(guān)系。而牛肉作為我國主要動物性食品之一，在屠宰、運輸或銷售等環(huán)節(jié)中都會受到污染。通過對大慶地區(qū)牛肉污染情況分析，不僅提高人們對動物性食品安全的關(guān)注，還為我們的預(yù)防工作提供參考依據(jù)。

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