抗風濕類中成藥和保健食品中非法添加化學成分的高液相色譜-質譜/質譜法檢測

黎雪清 魯藝 王鐵杰 殷果 韓東岐 江坤

廣東省深圳市藥品檢驗所深圳藥品質量標準研究重點實驗室，廣東深圳518057

抗風濕類中成藥和保健食品中非法添加化學成分的高液相色譜-質譜/質譜法檢測

黎雪清 魯藝 王鐵杰 殷果 韓東岐 江坤

廣東省深圳市藥品檢驗所深圳藥品質量標準研究重點實驗室，廣東深圳518057

目的建立一種快速檢測抗風濕類中成藥和保健食品中30種非法添加化學成分的高液相色譜-質譜/質譜法。方法色譜條件:C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.1%乙酸溶液為流動相，梯度洗脫，質譜條件:電噴霧離子化正離子檢測(ESI+)，全掃描一級質譜、選擇離子二級掃描質譜檢測方式，掃描范圍50～800 aum，對抗風濕類中成藥和保健食品中非法添加的化學成分進行快速定性分析。結果根據(jù)檢測到的化合物的色譜保留時間及一級、二級質譜信息，并與對照品比較，可作為分析抗風濕類中成藥和保健食品中非法添加嗎啡、甲氧芐啶、對乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲惡哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30種化學成分的有效手段。在50批供試品中，檢測到有10種供試品中含有非法添加的化學成分。結論本方法專屬性強、靈敏度高，可作為抗風濕類中成藥和保健食品中非法添加化學成分的快速檢測方法。

液質聯(lián)用法;快速檢測;抗風濕類;非法添加

我國地理緯度跨度大，高寒、高濕地區(qū)多，導致我國具有較高的風濕病發(fā)病率［1］。風濕性及類風濕性關節(jié)炎以疼痛、麻木、關節(jié)活動不靈為主要癥狀，是一種致殘性非常強的疾?。?-3］?；谏鲜銮闆r，不法商家為牟取暴利，突顯產品療效，在抗風濕類中成藥和保健食品中非法添加化學物質［4-5］，使通常起效慢的中藥和保健食品似乎具備了速效、高效的優(yōu)點。在健康產品中非法添加的化學藥物，未經試驗驗證、臨床驗證和國家相關部門嚴格審核批準，本身質量安全難以控制保證，而且存在隨意性和不確定性。這種非法現(xiàn)象會給社會和消費者帶來了嚴重的，甚至導致死亡的威脅，同時引起了國家相關監(jiān)管部門的重視。建立完善的檢測非法添加化學藥物的專屬性方法具有重要的現(xiàn)實意義。由于中成藥和保健食品添加的化學成分種類繁多、基體復雜，對分析儀器的檢測能力要求苛刻，現(xiàn)代質譜技術是目前眾多分析化學方法中同時具備了靈敏度高、特異性好、普適性強、高通量等優(yōu)點的分析方法，可對多組分混合物定性鑒定和分子結構的準確判定［6-8］。

高效液相色譜-離子阱-飛行時間高分辨質譜(LCMS-IT-TOF)在現(xiàn)有各廠家質譜儀不能同時實現(xiàn)多級質譜功能和精確質量測定的行業(yè)現(xiàn)狀下，實現(xiàn)了離子阱質譜和飛行時間質譜的完美結合，從而實現(xiàn)既可以做多級質譜，又能達到高質量精度的強大功能。充分利用IT-TOF獲得的多級質譜數(shù)據(jù)，在一級質譜發(fā)現(xiàn)的候選物的基礎上，進一步通過多級質譜的數(shù)據(jù)對比，確認真正的物質，使成分鑒定更準確，離子信息更豐富。

本研究以國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件“抗風濕類中成藥”(批準件編號2009025)［9］為基礎，結合市場上新發(fā)現(xiàn)的非法添加化學成分情況，采用LCMS-TI-TOF對待測成分進行定性分析，獲得高準確度、高分辨率、高靈敏度的多級質譜信息，準確快速驗證非法添加的化學成分結構，建立了快速檢測抗風濕類中成藥和保健食品中嗎啡、甲氧芐啶、對乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲嗯哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松等30種非法添加化學成分的液質聯(lián)用方法［10-14］，進一步為打擊藥品和保健食品制假售假工作提供了有效的手段［15］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LCMS-IT-TOF液質聯(lián)用儀(日本島津公司，SIL-20A自動進樣器，電噴霧離子源(ESI)，LCMSolution色譜工作站);XS105DU十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司);Milli-Q Academic純水器(美國MILLIPORE公司);SB25-12DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

氨基比林(批號:100503-200301)、嗎啡(批號: 171201-201324，含量99.1%)、甲氧芐啶(批號:10031-200304)、對乙酰氨基酚(批號:100018-200408)、羅通定(批號:100452-200301)、龍膽苦苷(批號:200106)、磺胺甲嗯哇(批號:100025-200904，含量99.8%)、安替比林(批號:100506-200301)、阿司匹林(批號: 100113-201104)、鹽酸美沙酮(批號:171243-200602)、潑尼松(批號:100199-201002，含量98.5%)、可的松(批號:101128-201001，含量97.2%)、異丙安替比林(批號:100525-200301)、吡羅昔康(批號:100177-200603，含量99.8%)、氫化可的松(批號:100152-200206)、金諾芬(批號:100272-201202)、地塞米松(批號:100129-200804，含量99.6%)、醋酸曲安奈德(批號:100125-201105，含量97.8%)酮洛芬(批號: 100337-200502)、萘普生(批號:100198-200403)、地西洋(批號:171225-200903，含量99.9%)、醋酸地塞米松(批號:100122-201206)、保泰松(批號:100481-200601，含量99.9%)、奧沙普秦(批號:100353-200301)、雙氯芬酸鈉(批號:100334-200302)、丙酸倍氯米松(批號:100119-200603)對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供;非那西丁(批號:81105，含量98.5%，德國DR.EHRENSTORFER)、甲基潑尼松龍(批號:20100402，EDQM)、舒林酸(批號:10J345，含量99.8%，USP)、吲哚美辛(批號:01105，含量99.0%，德國DR.EHRENSTORFER);甲醇和乙酸均為色譜純;水為超純水(自制)。待測樣品均為市售。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

CAPCELLPAKC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇(A)和0.1%乙酸溶液(B)，梯度洗脫:0～5min，40%～50%A;5～25 min，55%～60%A;25～40 min，70%～75%A;40～45 min，90%A。柱溫:35℃;樣品室溫度: 20℃;進樣量:10 μL;體積流量:1.0 mL/min(分流比為1∶5)。

2.2 質譜條件

質譜裝配電噴霧電離源(ESI);m/z 50～800 amu;噴霧氣流:1.5 L/min;曲型脫溶劑管(CDL)溫度:200℃;加熱板溫度:200℃;檢測電壓:1.65 kV;干燥氣(N2)電壓:112 kPa;碰撞能量范圍:20%～70%;正離子模式檢測。掃描方式采用全掃描一級質譜、選擇離子二級掃描質譜監(jiān)測(MS/MS)。

2.3 對照品溶液的配制

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升中各含嗎啡、甲氧芐啶、對乙酰氨基酚、羅通定、氨基比林、龍膽苦苷、磺胺甲惡哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、鹽酸美沙酮、潑尼松、可的松、異丙安替比林、吡羅昔康、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、醋酸曲安奈德、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和丙酸倍氯米松0.1 mg的混合對照品貯備液;精密量取上述貯備液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液的配制

取供試品(相當于一次口服劑量)研細，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上清液適量加甲醇稀釋100倍，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.5 質譜特征

取混合對照品溶液，按上述質譜條件檢測。部分化學成分不能達到完全分離，但因各待測成分的準分子離子峰不同，通過質譜的高靈敏和高選擇測定，不會造成相互間的干擾。記錄全掃描一級質譜、選擇離子二級質譜信息。30種化學成分的質譜參數(shù)見表1。

2.6 樣品測定

按“2.4”項下制備供試品溶液，在上述色譜和質譜條件下測定，共測50批樣品，其中包括中成藥24批，保健食品26批。測得樣品呈陽性的結果見表2。部分對照品及供試品的一級及二級質譜圖見圖1。

3 討論

3.1 液質聯(lián)用法優(yōu)勢

中成藥和保健食品添加的化藥成分種類繁多、基體復雜［16］，采用化學方法或者高效液相色譜法進行檢測時，容易出現(xiàn)假陽性結果;通過一級全掃描模式可獲得化合物的準分子離子峰，但若遇復雜的基質，同樣容易出現(xiàn)假陽性結果，因此需提取該分子離子為母離子進行二級掃描獲得碎片信息。本文采用液質聯(lián)用法，基于LCMS-IF-TOF譜，對待測成分進行定性分析，獲得高質量準確度、高分辨率和高靈敏度的多級質譜LCMS-IT-TOF信息，準確快速驗證非法添加的化學成分結構。通過比較對照品及供試品的保留時間、一級質譜分子離子峰及二級質譜碎片等信息，對供試品進行結果確證，提高檢測的專屬性。

3.2 檢測模式選擇

由于待測成分繁多，為了全面快速驗證多種化學成分，利用離子阱(IT)和飛行時間(TOF)技術優(yōu)勢，可以完成MS1的正離子模式和負離子模式的自動切換并掃描，并可以進行MSn的正離子模式和負離子模式的相互之間切換并掃描。盡管相互切換的時間很短，但正離子模式和負離子模式下的高質量準確度仍然是可以確保的。故本研究采用同時對待測成分進行正負離子模式檢測，結果發(fā)現(xiàn)待測成分中安替比林和非那西丁由于存在酰胺鍵(-CO-NH)在負離子檢測模式(ESI-)下響應較差，且適合負離子檢測的成分在正離子模式(ESI+)下響應較好，待測成分均易加氫或者加鈉形成正電荷離子峰。因此，本法最終采用ESI+同時檢測30種待測成分，大大簡化實驗操作，提高檢驗效率。

3.3 測定結果

隨著科技的進步，單一化學成分的效果有時沒有多種成分的合理組合更有利于調整人的生理功能，更利于改善產品的質量特征。通過測定結果可見，造假分子也會“與時俱進”把化學藥品中的組合應用行為轉移到中成藥、保健食品中，從非法添加單一成分轉向非法添加組合成分［15］。本研究發(fā)現(xiàn)添加的化學藥成分多屬于處方藥，服用時有嚴格的適應證、禁忌證，需要在醫(yī)生指導下才能安全有效使用?；颊咴诓恢榈那闆r下使用，輕則耽誤治療時機，加重治療成本，重則過量服用藥物，引起嚴重的不良反應，甚至導致死亡。非法添加化學藥成分的客觀事實已經對公眾生命財產安全形成威脅、造成危害。本方法快速、靈敏、準確，有效地同時檢測抗風濕類中成藥和保健食品非法添加的多種化學成分，為檢測和打擊非法添加行為提供更全面、更有力的技術支撐，提高監(jiān)督檢驗效率。

筆者還運用上述色譜系統(tǒng)建立了一種在45 min內快速篩查嗎啡、甲氧芐啶、對乙酰氨基酚嗎啡、甲氧芐啶、對乙酰氨基酚、龍膽苦苷、磺胺甲惡哇、安替比林、阿司匹林、非那西丁、潑尼松、異丙安替比林、氫化可的松、金諾芬、地塞米松、甲基潑尼松龍、酮洛芬、舒林酸、萘普生、地西洋、醋酸地塞米松、保泰松、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、丙酸倍氯米松等24種抗風濕類化學成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測器快速篩查方法以便監(jiān)督檢驗。

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Rapid determination of chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products by HPLC-MS/MS

LI XueqingLU YiWANG TiejieYIN GuoHAN DongqiJIANG KunShenzhen Institute for Drug ControlShenzhen Key Laboratory of Drug Quality Standard Research，Guangdong Province，Shenzhen518057，China

Objective To establish an HPLC-MS/MS method for rapid determination of 30 chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products.Methods The HPLC chromatographic determination was condcted on C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm).The gradient elution was done with the mixed solution of methanol-0.1%acetic acid.The mass spectrometer condition was as follows:the ionition mode was ESI+，the mode was mass scan and daughter scan with scan range from 50 to 800 aum，and the chemicals in sample were rapid screended and identified.Results Chemicals added illegally，ncluding Morphine，Trimethoprim，Paracetamol，Rotundine，Aminopyrine，Gentiopicroside，Sulfamethoxazole，Phenazone，Aspirin，Phenacetin，Methadone hydrochloride，Prednisone，Cortisone，Propyphenazone，Piroxicam，Hydrocortisone，Auranofin，Dexamethasone，Methylprednisolone，Triamcinolone acetonide acetate，Ketoprofen，Sulindac，Naproxen，Diazepam，Dexamethasone acetate，Phenylbutazone，Oxaprozin，Diclofenac sodium，Indomethacin and Beclomethasone dipropionate，were identified according to the spectrum，chromatogramphic behavior and mass spectral data by comparison with those of reference substances.Chemicals added illegally were detected in 10 samples from 50 samples.Conclusion The method is sufficiently selective，sensitive and can be employed in the rapid determination of chemicals added illegally in anti-rheumatic traditional Chinese medicines and health products.

HPLC-MS/MS；Rapid determination；Anti-rheumatic；Illegally addition

R917

A

1673-7210(2015)02(c)-0086-05

2014-11-25本文編輯:衛(wèi)柯)

廣東省深圳市基礎研究項目(編號JCYJ20120618 153944322)。

黎雪清(1987.1-)，女，碩士研究生;研究方向:藥物質量分析與標準研究。