虎黃燒傷凝膠劑的制備及質(zhì)量控制

楊君 張洪 魏丹蕓

武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430060

虎黃燒傷凝膠劑的制備及質(zhì)量控制

楊君 張洪 魏丹蕓

武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢430060

目的確定虎黃燒傷凝膠劑的制備工藝并建立其質(zhì)量控制的方法。方法通過單因素實(shí)驗(yàn)以凝膠劑的成型性和穩(wěn)定性為考察指標(biāo)，篩選出最適宜的載藥基質(zhì)。采用高效液相色譜法同時(shí)測定該制劑中虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果虎黃燒傷凝膠劑的最佳基質(zhì)材料為2.5%的羥丙甲基纖維素;虎杖苷質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為Y=79 415X-444 889(r=0.9994)，線性范圍為15.6～78.0 μg/mL;鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為Y=65 576X-583 154(r=0.9996)，線性范圍為34.75～173.75 μg/mL;平均加樣回收率分別為99.34%、99.64%(n=6)。結(jié)論本研究制劑制備工藝簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，含量測定方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，促進(jìn)了該制劑在臨床上的應(yīng)用。

虎黃燒傷凝膠劑;制備;質(zhì)量控制;高效液相色譜法

虎黃燒傷凝膠是一種用于治療皮膚熱損傷的中藥制劑，其依據(jù)中醫(yī)理論清熱解毒、活血化疲、通絡(luò)、收斂、去腐生肌的組方原則，篩選出以虎杖和黃連等2味藥材為處方并結(jié)合現(xiàn)代藥劑學(xué)方法研制而成。一直以來，武漢大學(xué)人民醫(yī)院自制制劑——燒傷酊，是將虎杖和黃連飲片用適量的乙醇浸泡、壓濾，待澄清后封裝而成，該藥在臨床上用于燒燙傷的治療效果明顯，但酊劑易揮發(fā)，穩(wěn)定性差，易產(chǎn)生皮膚刺激，影響使用效果。而凝膠劑在這些方面卻具有明顯的優(yōu)勢，不僅具有良好的生物相容性，且易于涂布使用，局部給藥后易吸收、穩(wěn)定性較好［1］，凝膠涂抹層可防止外來刺激和預(yù)防細(xì)菌感染，為創(chuàng)面組織的修復(fù)和再生提供有利環(huán)境［2］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床需要對常用酊劑進(jìn)行劑型改良研究，確定了虎黃燒傷凝膠劑的制備工藝，并建立了以高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測定該制劑中虎杖苷和鹽酸小檗堿含量的質(zhì)量控制方法，該方法簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

分析電子天平;紫外分光光度儀(島津UV-1800);高效液相色譜儀(島津LC-20AT);SPD-20A紫外檢測器;Agilent Extend-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);精密恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);超聲波清洗器(SK5200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);高速冷凍離心機(jī)(H-1600RW，武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 試藥

虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號: 111575-200502);鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110713-201212);虎杖(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號:20131201);黃連(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司，批號:20131253);乙醇(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純，Tedia company);乙腈(色譜純，Tedia company);三乙醇胺(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甘油(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

凝膠藥用輔料均為藥用級別，卡波姆940、卡波姆943、卡波姆974、殼聚糖、羥丙甲基纖維素(HPMCK4M)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)均購于北京化學(xué)試劑公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖-黃連提取液的制備

參考有關(guān)虎杖和黃連提取研究的文獻(xiàn)［3-7］設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以乙醇濃度、提取溫度、提取次數(shù)和料液比為可變因素，考察其不同水平對有效成分虎杖苷和鹽酸小檗堿的提取率(通過HPLC測得)影響。根據(jù)大量文獻(xiàn)資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采取以下方法制備虎杖-黃連提取液可使虎杖苷和鹽酸小檗堿有較高的提取率:分別取處方量虎杖粗粉15 g和黃連粗粉10 g，用65%乙醇在70℃水浴回流提取3次，每次1.5 h，料液比為1∶10(g/mL)，趁熱過濾，合并提取液，60℃減壓濃縮至無醇味，用蒸餾水調(diào)至一定體積，濾過，備用。

2.2 虎黃凝膠制備工藝研究

2.2.1 基質(zhì)載藥實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取卡波姆940、卡波姆934、卡波姆947、殼聚糖、HPMC-K4M和CMCNa為基質(zhì)，分別于適量純化水中溶脹溶解，制備空白凝膠。將虎杖-黃連提取液預(yù)熱至50℃，緩慢加入空白凝膠，邊加邊攪拌，觀察藥物凝膠的成型性，結(jié)果見表1。

卡波姆對鹽類敏感［8-9］，而藥物提取濃縮液中含有的鹽酸小檗堿為季銨鹽，為其凝膠渾濁原因之一。殼聚糖載藥能力差，容易產(chǎn)生水化現(xiàn)象。因此舍棄卡波姆和殼聚糖，根據(jù)表1結(jié)果對HPMC-K4M和CMCNa作進(jìn)一步考察。

2.2.2 穩(wěn)定性考察根據(jù)“2.2.1”項(xiàng)下結(jié)果，以HPMCK4M和CMC-Na為載藥基質(zhì)制備藥物凝膠，在凝膠中加入潤濕劑甘油10%，防腐劑山梨酸鉀0.2%，觀察凝膠劑在不同條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2結(jié)果，確定選用HPMC-K4M作為虎黃燒傷凝膠劑的載藥輔料。

2.2.3 虎黃燒傷凝膠劑中HPMC-K4M用量優(yōu)選以HPMC-K4M為載藥輔料制備不同HPMC-K4M含量的虎黃燒傷凝膠，根據(jù)凝膠的成型性、涂展性和穩(wěn)定性進(jìn)一步確定HPMC的最佳用量，結(jié)果見表3。

由表3確定虎黃燒傷凝膠劑中HPMC-K4M的最佳用量為2.5%。

2.3 虎黃燒傷凝膠劑的制備

根據(jù)原有處方的藥物比例和上述凝膠劑成型工藝的研究結(jié)果，確定虎黃燒傷凝膠劑的制備方法如下:分別稱取虎杖粗粉15 g、黃連粗粉10 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備虎杖-黃連提取液(約300 mL)，加山梨酸鉀1 g使溶解，得相Ⅰ;取HPMC-K4M 12.5 g，加甘油50 g混合均勻，加適量純化水溶脹溶解，靜置過夜，得相Ⅱ。將相Ⅰ預(yù)熱至50℃并緩慢加入相Ⅱ，攪拌均勻，最后補(bǔ)足蒸餾水至500 g，攪拌均勻至冷卻，得虎黃燒傷凝膠。

3 質(zhì)量控制

3.1 性狀

本制劑為質(zhì)地細(xì)膩，均勻的黃褐色半透明半固體凝膠。

3.2 檢查

取本品2 g，加20 mL純化水?dāng)嚢柚寥芙夂鬁y定pH，pH值應(yīng)為6～7。其他檢查均符合《中國藥典》2010年版二部凝膠劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定［10］。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.3.1 離心穩(wěn)定性取3份10 g的樣品分別裝入規(guī)格為10 mL(外徑為15.5 mm)離心管中，以3000 r/min離心30 min，凝膠無分層現(xiàn)象。

3.3.2 耐熱耐寒試驗(yàn)各取3份10 g裝入離心管中的樣品，分別放入50℃烘箱恒溫12 h及冰箱中-20℃冷凍12 h，凝膠無分層，且恢復(fù)至常溫后無分層，無顏色變化。

3.4 皮膚刺激性試驗(yàn)

取12只豚鼠，雌雄各半，體重均約為300 g，分為兩組，一組設(shè)為破損皮膚組，另一組設(shè)為完整皮膚組。均剃去豚鼠脊柱兩側(cè)鼠毛，兩側(cè)脫毛面積各為4 cm× 4 cm。對破損皮膚組豚鼠脫毛處采用滅菌針尖劃傷處理，以見有血液滲出為度，兩側(cè)處理傷口損傷程度相當(dāng)。24 h后給兩組所有豚鼠脊柱右側(cè)涂抹自制虎黃燒傷凝膠劑，給左側(cè)涂抹不含藥物的空白基質(zhì)凝膠，豚鼠無尖叫、屈身、逃逸等現(xiàn)象，6 h后用棉簽蘸溫水溫和除去豚鼠皮膚上的凝膠層，觀察皮膚均無明顯紅斑和水腫，豚鼠活動(dòng)表現(xiàn)正常。

3.5 含量測定

3.5.1 色譜條件色譜柱:Agilent Extend-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀(磷酸調(diào)節(jié)pH至4.2)，梯度洗脫程序:0 min(76%B)→6 min(76%B)→12 min (70%B)→15 min(40%B)→16 min(40%B)→25 min (76%B);檢測波長為324 nm;流速為1.00 mL/min;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下樣品各組分分離良好，虎杖苷及鹽酸小檗堿與相鄰未知色譜峰的分離度不低于1.6，理論塔板數(shù)以鹽酸小檗堿計(jì)不低于5000。對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的色譜圖見圖1。

3.5.2 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的虎杖苷對照品3.12 mg，鹽酸小檗堿對照品6.95 mg，置于10 mL棕色容量瓶中。加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為312 μg/mL虎杖苷和695 μg/mL鹽酸小檗堿的混合對照品溶液。

3.5.3 供試品溶液的制備精密稱定按“2.3”項(xiàng)下方法配制而成的凝膠2.03 g，置于一個(gè)10 mL(外徑為15.5 mm)圓底連蓋離心管中，加入適量甲醇，超聲15 min后在高速離心機(jī)中以15 000 r/min離心10 min，取上清加入25 mL容量瓶中，重復(fù)此步驟3次，收集3次所得上清液，補(bǔ)足甲醇至刻度，搖勻，取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

3.5.4 陰性對照溶液制備按照處方組成，依次加入除虎杖-黃連混合提取液的其他材料制備空白基質(zhì)凝膠，并按照“3.5.3”項(xiàng)下制備供試品溶液的方法制備陰性對照品溶液。

3.5.5 線性關(guān)系考察分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取適量過0.45 μm濾膜，然后依次進(jìn)樣。以溶液濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；⒄溶盏幕貧w方程為:Y=79 415X-444 889，r=0.9994，線性范圍為15.6～78.0 μg/mL;鹽酸小檗堿的回歸方程為:Y=65 576X-583 154，r= 0.9996，線性范圍為34.75～173.75 μg/mL。

3.5.6 精密度實(shí)驗(yàn)取上述對照品溶液，分別在同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度。結(jié)果虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD分別為1.61%和1.66%。在5日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算日間精密度，結(jié)果虎杖苷和鹽酸小檗堿的RSD分別為2.13%和2.37%，表明儀器精密度良好。

3.5.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一份凝膠制劑，按供試品溶液的制備方法制得6份，在上述色譜條件下測定。結(jié)果虎杖苷的平均含量為52.73 μg/mL，RSD為0.76% (n=6);鹽酸小檗堿的平均含量為97.64 μg/mL，RSD為1.09%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

3.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定，結(jié)果表明虎杖苷和鹽酸小檗堿在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，虎杖苷RSD為1.3%，鹽酸小檗堿RSD為0.47%，說明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)從已知含量的同一批虎黃燒傷凝膠中精密稱取6份約1 g的樣品，分別精密加入高、中、低不同濃度的對照品溶液，按“3.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并分別在“3.5.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

3.5.10 樣品含量測定從3份相同制備方法不同批次制備的虎黃燒傷凝膠中取樣，按“3.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照“3.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定含量并折算成每克虎黃燒傷凝膠中虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

4 討論

制備凝膠劑，首先得選擇合適的載藥基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在選擇凝膠基質(zhì)時(shí)，對常用高分子材料進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)CMC-Na和HPMC均比較適合作此載藥材料，但因最終藥用制劑需加入一定量的防腐劑山梨酸鉀，而加入山梨酸鉀后HPMC穩(wěn)定性更佳，所以選擇HPMC。由HPMC制備而成的凝膠細(xì)膩均勻，釋藥快，與皮膚黏附貼合效果好，能吸收患處的組織滲出液，且具有一定的成膜性［11］，保護(hù)創(chuàng)面組織，非常適合此凝膠制備。

虎杖苷和鹽酸小檗堿在熱水中的溶解度均大于其在冷水中的溶解度，但在過熱的環(huán)境下鹽酸小檗堿不穩(wěn)定［12］，因此在凝膠制備過程中將虎杖-黃連提取液加熱到50℃使藥物活性成分充分溶解分散再加入空白基質(zhì)，形成的藥物凝膠更加均勻。

虎黃燒傷凝膠中主要活性物質(zhì)為虎杖苷和鹽酸小檗堿，因此二者的含量是該制劑質(zhì)量控制及臨床療效的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)通過文獻(xiàn)［10，13］考察并結(jié)合對色譜條件的實(shí)際摸索，建立HPLC法同時(shí)測定虎杖苷和鹽酸小檗堿含量的方法，提高了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于兩種物質(zhì)的最大吸收波長不同，因此分別對虎杖苷和鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液進(jìn)行全波長掃描，選取幾個(gè)二者均有較大吸收的波長，如296、307、345、324 nm，在上述色譜條件下對供試品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在324 nm處所得HPLC圖譜各峰分離效果好，雜質(zhì)干擾少，也較好地兼顧了峰形。

隨著近些年來中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥制劑在燒燙傷的治療中顯示出其不可替代的重要性［14］。本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)中藥結(jié)合應(yīng)用新型高分子材料制備成現(xiàn)代凝膠劑，并建立可行的質(zhì)量控制方法，為虎黃燒傷凝膠的制備及質(zhì)量控制提供了方法依據(jù)，為該制劑的臨床應(yīng)用提供了質(zhì)量保證。

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Preparation and quality control of Hu-Huang Burn Gel

YANG JunZHANG HongWEI DanyunDepartment of Pharmacy，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

Objective To confirm the preparation technology of Hu-Huang Burn Gel and establish its quality control method.Methods The formability and stability of the gels were taken as examining index by the single factor experiment，and through which the most appropriate matrix for the Chinese medicine extract was selected.The HPLC method was used for simultaneous determination of the content of polydatin and berberine hydrochloride in the formulation.Results 2.5%HPMC-K4M was proved to be the optimum matrix.The linear regression equation of polydatin about concentration and peak area was Y=79 415X-444 889(r=0.9994)，the linear range was 15.6-78.0 μg/mL；the linear regression equation of berberine hydrochloride about concentration and peak area was Y=65 576X-583 154(r=0.9996)，the linear range was 34.75-173.75 μg/mL；and the respectively average recovery was 99.34%and 99.64%(n=6).Conclusion The preparation of Hu-Huang Burn Gel is simple and the nature of this formulation is stable，the assaying method is accurate with well reproducibility，which can promote the application of the formulation in the clinic.

Hu-Huang Burn Gel；Preparation；Quality control；High performance liquid chromatography

R283.1

A

1673-7210(2015)02(c)-0082-05

2014-10-29本文編輯:衛(wèi)柯)

楊君，女，武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部2012級在讀碩士研究生。

張洪，男，湖北武漢人，碩士，教授，武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥品試劑供應(yīng)科主任;研究方向:消化系疾病治療藥物的藥劑學(xué)與藥理學(xué)研究。