動物源食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留檢測超高效液相色譜-串聯質譜法研究

陳薔，宋志超，張崇威，朱雷

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

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動物源食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留檢測超高效液相色譜-串聯質譜法研究

陳薔，宋志超，張崇威，朱雷

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

建立了動物源食品中酰胺醇類藥物(氯霉素CAP、甲砜霉素TAP、氟苯尼考FF)及其代謝物(氟苯尼考胺FFA)殘留檢測的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法。樣品經氨化乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，氨化乙酸乙酯反萃取，電噴霧正/負離子多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測。四種藥物在0.2～50μg/L的系列濃度范圍呈線性相關，樣品中CAP的檢測限為0.1μg/kg，定量限為0.2μg/kg；TAP、FF、FFA檢測限為0.5μg/kg，定量限為1.0μg/kg。在0.2～5μg/kg的添加濃度范圍內平均回收均為80%～120%，變異系數均小于15%。結果表明該方法簡單快速、靈敏度高、重復性好，適用于動物源食品中酰胺醇類及其代謝物殘留檢測。

動物源食品；酰胺醇類藥物；代謝物；殘留；超高效液相色譜-串聯質譜

酰胺醇類屬于廣譜抗生素，包括氯霉素(CAP)及其衍生物，常見的藥物包括氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)。CAP在動物具有較高的治療指數[1]，但其對骨髓造血機能有抑制作用，可引起血小板減少、粒細胞缺乏癥、再生障礙性貧血、溶血等，美國食品及藥物管理局于1984年將其列為法定禁用獸藥，許多國家嚴格禁止將CAP用于食品動物(特別是蛋雞和奶牛)，我國農業(yè)部在2002年也將CAP列入《食品動物禁用獸藥及其化合物清單》。TAP為CAP的衍生物，毒性較CAP低，具有較強的免疫抑制作用。FF是一種TAP的衍生物，分子中不含與抑制骨髓造血機能有關的-NO2基團，大大降低了對動物和人體的毒性且抗菌活性優(yōu)于CAP和TAP，FF雖不會引起骨髓抑制和再生障礙性貧血，但具有胚胎毒性。由于在獸醫(yī)臨床和養(yǎng)殖過程的濫用、誤用抗生素，細菌耐藥性問題越來越嚴重，因此各國制訂了酰胺醇類的最大殘留限量。

酰胺醇類的殘留檢測方法有ELISA法[2]、EIA法[3]、HPLC法[4]、GC法[5]、GC-MS法[6]和LC-MS/MS法[7]等，其中確證方法主要是質譜法。GC法和GC-MS法均需要進行衍生化，前處理較為繁瑣，定量亦不夠準確，而LC-MS/MS法具有快速、簡便、定性定量準確、靈敏度高的特點，已成為目前多殘留檢測確證普遍使用的方法。酰胺醇類的LC-MS/MS檢測標準多為單一藥物或多種藥物原型的檢測方法，但FF在動物源食品中的主要代謝產物為氟苯尼考胺(FFA)，故檢測酰胺醇類及其代謝物FFA更具有實際意義。本研究建立了豬、雞、牛、羊(肌肉、肝臟、腎臟)、雞蛋、牛奶中CAP、TAP、FF和FFA殘留檢測的UPLC-MS/MS方法，為動物源食品中酰胺醇類及其代謝物殘留監(jiān)測提供了簡單快速、靈敏度高的檢測技術。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 Acquity UPLC-Xevo TQ-S質譜聯用儀，配電噴霧離子源(ESI),美國Waters公司；XP205電子分析天平,感量0.01 mg,梅特勒-托利多儀器公司；ALC-2100.2電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；IKA MS3 Basic渦旋混合器,廣州儀科實驗室技術有限公司；TARGIN TECH VX-03多管渦旋振蕩器,北京踏錦科技有限公司；3K-30離心機,Sigma公司；TTL-DC II氮吹儀,北京同泰聯科技發(fā)展有限公司；100 μL、200 μL、1000 μL、5000 μL移液器,德國Eppendorf公司。

1.2 試劑 CAP、TAP、FF標準品,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;FFA標準品,TRC公司；氯霉素-D5(CAP-D5)標準品,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲砜霉素-D3(TAP-D3)、氟苯尼考-D3(FF-D3)、氟苯尼考胺-D3(FFA-D3)標準品,TRC公司；乙腈、甲醇為色譜純，Sigma公司；氨水、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、氯化鈉、甲酸銨、正己烷為分析純；試驗用水為Milli-Q高純水。

1.3 標準和內標溶液的配制 準確稱取CAP、TAP、FF、FFA標準品適量，用甲醇溶解并稀釋成約100 μg/mL的標準貯備液；分別稱取CAP-D5、TAP-D3、FF-D3、FFA-D3標準品適量，用甲醇溶解并稀釋成約100 μg/mL的內標貯備液。分別準確吸取CAP、TAP、FF、FFA標準貯備液適量，用甲醇稀釋至含CAP為1 μg/mL，其余為5 μg/mL的混合標準中間液?；旌蟽葮酥虚g液同法配制，并用20%甲醇溶液稀釋成含CAP-D5為10 μg/L、TAP-D3、FF-D3、FFA-D3為50 μg/L的混合內標工作液。

1.4 樣品前處理 稱取2±0.02 g試樣(豬、雞、牛、羊的肌肉、肝臟和腎臟組織、雞蛋、牛奶)于50 mL離心管中，添加混合內標工作液100 μL，加乙酸乙酯-氨水(98∶2)10 mL，渦旋混勻(牛奶樣品另加無水硫酸鈉3 g，混勻)，渦旋振蕩10 min，8000 r/min離心5 min，取上清液于另一50 mL離心管中；殘渣用乙酸乙酯-氨水(98∶2)10 mL重復提取一次，合并乙酸乙酯層。提取液于50℃水浴吹干，在殘留物中加入4%氯化鈉溶液3 mL，渦旋使溶解，再加入4%氯化鈉溶液飽和的正己烷5 mL，渦旋混合30 s，8000 r/min離心5 min，棄去正己烷，重復脫脂一次。在下層水相中加入乙酸乙酯-氨水(98∶2)5 mL，渦旋振蕩5 min，8000 r/min離心5 min，吸取上層有機相于10 mL離心管中，用乙酸乙酯-氨水(98∶2)5 mL重復萃取一次，合并有機相，50 ℃水浴吹干，殘渣加入20%甲醇溶液1.0 mL，渦旋使復溶，過0.22 μm濾膜供UPLC-MS/MS儀測定。

1.5 儀器分析條件 色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) ，流動相A為乙腈，B為5 mmol/L的甲酸銨溶液，梯度洗脫條件見表1，流速0.3 mL/min，柱溫35℃，進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫條件

電離電壓為3.0 kV(負離子模式)和1.5kV(正離子模式)，源溫150℃；脫溶劑氣溫度500℃；錐孔氣流速150 L/Hr；脫溶劑氣流速1000 L/Hr；多反應監(jiān)測(MRM)模式采集。各藥物的定性、定量離子對、離子源、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

表2 藥物的定性、定量離子對、離子源、錐孔電壓和碰撞能量

2 結果

2.1 標準曲線 精密量取酰胺醇類混合標準中間液和混合內標工作液適量，加20%甲醇溶液配制成含CAP 0.2、0.4、1、2、4、10 μg/L和含TAP、FF、FFA 1、2、5、10、20、50 μg/L的標準曲線，其中CAP-D5濃度為1 μg/L，其余三種內標濃度為5 μg/L。在本方法確定的條件下，以測試藥物和其對應的內標的特征離子質量色譜峰面積比為縱坐標，溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，各藥物線性關系良好，相關系數r均大于0.999，見表3。

表3 藥物標準曲線及相關系數

2.2 檢測限和定量限 采用在空白組織中添加目標化合物的方法，依據特征離子色譜峰信噪比S/N≥3為方法檢測限，S/N≥10為方法定量限，測得CAP的檢測限為0.1 μg/kg，定量限為0.2 μg/kg；TAP、FF、FFA的檢測限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg。對照溶液、空白雞肝及空白雞肝添加各藥物后得到的特征離子質量色譜圖見圖1-圖3。

圖1 酰胺醇類對照溶液特征離子質量色譜圖

圖2 空白雞肝特征離子質量色譜圖

2.3 精密度與準確度 在空白雞肝中分別添加LOQ、2.5LOQ、5LOQ三個濃度的藥物進行回收率試驗，每一個濃度做5個平行，按內標法以峰面積比計算，其平均回收率、變異系數見表4。同時考察雞肌肉、腎臟組織和豬、牛、羊肌肉、肝臟、腎臟組織以及雞蛋、牛奶，顯示各藥物的平均回收率均為80%～120%，變異系數均小于15%(表5-表17)，滿足殘留分析的要求。

3 討論與小結

3.1 質譜條件優(yōu)化 在ESI-模式下對CAP、TAP、FF及其內標進行母離子掃描，確定其質子化分子離子[M-H]-，在ESI+模式下對FFA及其內標進行離子掃描，確定其質子化分子離子[M-H]+，以這些分子離子作為母離子對其子離子進行掃描，確定其子離子并優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數。

3.2 液相條件優(yōu)化 由于FFA極性相對其他三種酰胺醇類藥物較強，在反相色譜系統(tǒng)中保留時間較短，加之又采用ESI+模式，背景噪音及基質效應較強，需著重優(yōu)化FFA的保留時間，以減小基質效應。酰胺醇類殘留檢測的LC-MS/MS方法常用的流動相體系為乙腈-水[7]，采用ESI+模式采集時，通常在流動相中加入甲酸使分析物易于離子化，但ESI-模式會受到抑制。試驗嘗試用5 mmol/L甲酸銨溶液代替水，結果發(fā)現，在同樣的洗脫梯度條件下，乙腈-甲酸銨體系相對于乙腈-水體系CAP、TAP、FF及其內標物保留時間無差異，但FFA和FFA-D3保留時間增加且響應值大幅增加，故選擇乙腈-甲酸銨為流動相體系。

圖3 空白雞肝添加0.2 μg/kg CAP和1 μg/kg TAP、FF、FFA特征離子質量色譜圖

藥物添加濃度范圍/(μg·kg-1)平均回收率/%變異系數/%CAP0.2,0.5,192.0,93.5,93.06.2,4.6,5.4TAP1,2.5,5103.8,104.6,101.74.9,1.7,4.6FF1,2.5,592.3,85.6,83.94.5,1.4,2.4FFA1,2.5,5101.0,105.4,96.18.4,6.3,3.1

表5 空白雞肉中藥物添加回收率結果(n=5)

表6 空白雞腎中藥物添加回收率結果(n=5)

表7 空白豬肉中藥物添加回收率結果(n=5)

表8 空白豬肝中藥物添加回收率結果(n=5)

表9 空白豬腎中藥物添加回收率結果(n=5)

表10 空白牛肉中藥物添加回收率結果(n=5)

表11 空白牛肝中藥物添加回收率結果(n=5)

表12 空白牛腎中藥物添加回收率結果(n=5)

表13 空白羊肉中藥物添加回收率結果(n=5)

表14 空白羊肝中藥物添加回收率結果(n=5)

表15 空白羊腎中藥物添加回收率結果(n=5)

表16 空白雞蛋中藥物添加回收率結果(n=5)

表17 空白牛奶中藥物添加回收率結果(n=5)

3.3 前處理條件的優(yōu)化 國內外關于酰胺醇類提取液的報道常見的有乙酸乙酯[4，6，8]、乙腈[9]、丙酮[10]、乙酸乙酯-乙腈-氨水[11]以及乙酸乙酯-氨水[5，7，11]等，由于CAP、TAP和FF呈弱酸性，FFA呈弱堿性，提取溶劑在不同pH條件下對性質不同的藥物提取效率有差別，當提取液呈堿性時，弱堿性的FFA呈分子態(tài)，利于FFA的萃取，從而提高回收率。在參考其他方法的基礎上，分別采用乙酸乙酯-乙腈-氨水(49∶49∶2)、乙酸乙酯-氨水(98∶2)兩種溶劑作為動物源食品中的酰胺醇類的提取液。結果表明：乙酸乙酯-乙腈-氨水提取液濃縮較慢，濃縮后殘渣較多，樣品基質效應大，在空白基質中添加酰胺醇類后FFA不出峰。而乙酸乙酯-氨水作為提取液毒性相對較小、干擾雜質少、容易蒸干、回收率穩(wěn)定。因而，本方法選擇了乙酸乙酯-氨水(98∶2)作為提取劑。

由于采用乙酸乙酯-氨水作為提取溶劑，有大量脂質及類脂物質同時被提取出來，必須進行凈化。正己烷作為常見的脫脂溶劑可以除去絕大部分脂肪及類脂物質，然而正己烷與乙酸乙酯互溶，不能直接在提取液中加入正己烷脫脂，必須將提取液轉化為與正己烷極性不同的溶劑體系，所以需要將提取液濃縮至干，然后用水溶液復溶。有報道將氨化乙酸乙酯提取液濃縮后用0.5%甲酸水溶液[7](或20%甲醇溶液或水)復溶，再用正己烷脫脂，在實際操作中發(fā)現，脫脂過程中極易產生乳化現象，而乳化部分藥物不能回收，降低了藥物的回收率和重復性。本試驗脫脂時在復溶液加入中性強電解質(氯化鈉)，利用其鹽析效應促進有機溶劑萃取、降低乳化并促使有機相與水相分層，從而達到脫脂和防乳化目的。脫脂后再用乙酸乙酯-氨水(98∶2)反萃取，4%氯化鈉溶液同樣提供一個鹽析環(huán)境，使酰胺醇類被有效地萃取出來。樣品經提取-脫脂-反萃取-再濃縮后，復溶液較澄清，可直接過濾上機。

試驗建立了豬、雞、牛、羊(肌肉、肝臟、腎臟)、雞蛋、牛奶等動物源食品中CAP、TAP、FF和FFA殘留檢測的UPLC-MS/MS方法，該方法簡單快速、靈敏度高、精密度好，可以滿足酰胺醇類及其代謝物殘留檢測的需要。

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(編 輯：陳希)

Determination of Amphenicols and Metabolite Residues in Animal Derived Food by UPLC-MS/MS

CHEN Qiang，SONG Zhi-chao，ZHANG Chong-wei，ZHU Lei

(HenanProvinceInstituteofVeterinaryDrugandfeedControl，Zhengzhou450008,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determination of amphenicols(CAP, TAP, FF) and metabolite(FFA) residues in animal derived food.The samples were extracted by ammoniated ethyl acetate.The fat was removed by hexane. The solution after defatting were extracted by ammoniated ethyl acetate again.The 4 drugs were detected by electrospray ionization in the positive /negative ion multiple reaction mode. The calibration curves of the 4 drugs were linear over the concentration ranges of 0.2～50 μg/L.The limit of detection of CAP was 0.1 μg/kg,and the limit of quantification was 0.2 μg/kg. The limits of detection of TAP,FF and FFA were 0.5 μg/kg,and the limits of quantification were 1 μg/kg. The control samples were spiked in 0.2～5 μg/kg，and the average recoveries ranged from 70% to 120%. The coefficient of variation was less than 15%. This method can be applied for the determination of amphenicols and metabolite residues in animal derived food.

animal derived food;amphenicols;metabolite;residue;UPLC-MS/MS

陳薔，碩士，獸醫(yī)師，從事獸藥殘留檢測和研究，E-mail：cqchongchong@163.com

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S859.84