植物內(nèi)生木霉的鑒定及其抑菌活性

孫勇　蔣繼宏　張海燕

摘要：對(duì)分離自健康植物的6種內(nèi)生木霉菌進(jìn)行活化，再觀察菌落形態(tài)、顏色，測(cè)量生長(zhǎng)速度，觀察孢子形態(tài)，測(cè)量孢子直徑范圍，進(jìn)而對(duì)供試菌株進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果初步鑒定，DBs0-13為多孢木霉（Trichoderma polysporum），DBs57為里氏木霉（T. reesei），DBs66為長(zhǎng)孢木霉（T. longipile），40為綠色木霉（T. viride），171為康氏木霉（T. koningii），292為哈茨木霉（T. harizianum）。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試真菌發(fā)酵液（相當(dāng)于稀釋10倍）對(duì)4種病原真菌的抑制效果。結(jié)果表明，6木霉菌對(duì)小麥赤霉菌、蘋果輪紋菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，其中DBs0-13和171的抑菌率相對(duì)較高，并對(duì)4種病原真菌都具有抑制作用；6種木霉菌中抑菌率最高的是DBs0-13，其對(duì)油菜菌核病菌、可可球二孢的抑制率分別為62.89%、41.12%。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生木霉菌；分類鑒定；形態(tài)特征；生長(zhǎng)速率；病原菌；抑菌活性；生防菌

中圖分類號(hào)： S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0332-02

收稿日期：2014-04-11

基金項(xiàng)目：江蘇省徐州師范大學(xué)?；穑ň幪?hào)：10XLA20）。

作者簡(jiǎn)介：孫勇（1977—），男，江西高安人，碩士，講師，從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蔣繼宏，教授。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。植物內(nèi)生菌是一定階段或全部階段生活于健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，目前已成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在生防載體菌而加以利用[1]。木霉屬（Trichoderma）屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目黏孢菌類[2]，分布比較廣泛，是典型的土壤和木材腐生真菌。木霉菌是有效的生物農(nóng)藥資源，適應(yīng)性廣，生存能力強(qiáng)，對(duì)植物病原菌拮抗作用廣譜，在防病的同時(shí)還能產(chǎn)生多種酶分解土壤中的植物殘?bào)w、降解大分子化合物以便吸收利用，能與土壤中其他益菌協(xié)調(diào)生長(zhǎng)、不污染環(huán)境等[3-5]。筆者在分離植物內(nèi)生菌的過程中獲得了幾株植物內(nèi)生木霉菌，鑒于木霉菌的生防特性，對(duì)分離到的內(nèi)生木霉菌進(jìn)行了分類鑒定和抗植物病原菌活性分析，為植物內(nèi)生木霉菌的利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1材料來源6株木霉供試真菌（DBs0-13、DBs57、DBs66、40、171、292）分離自健康植物組織中，為徐州師范大學(xué)藥用植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2抑菌試驗(yàn)用的病原真菌小麥赤霉病菌（Fusarium gramineaum Schwabe）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengriana f.sp. piricola）、油菜菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]、可可球二孢菌（B. theobromae Pat.），均為徐州師范大學(xué)藥用植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.3培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，pH值自然；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（發(fā)酵用的培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1木霉菌的活化將冷藏菌種取出，在無菌條件下用接種環(huán)挑取供試菌的少量菌絲（或0.5 cm×0.5 cm的菌落）至含PDA培養(yǎng)基的平板中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。

1.2.2木霉菌株生長(zhǎng)速度的測(cè)定將活化過的木霉菌落用打孔器打孔，獲得的菌餅接于新培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算出生長(zhǎng)速度，同時(shí)觀察菌落顏色、形狀等。

1.2.3載玻片的培養(yǎng)將滅過菌的PDA培養(yǎng)基于微波爐中融化，待培養(yǎng)基溫度降到40～45 ℃時(shí)于超凈工作臺(tái)中倒平皿，要倒得盡量?。?.1～0.2 cm厚），待冷卻。在上述培養(yǎng)皿中挑取大約0.5 cm×0.5 cm的培養(yǎng)基于滅過菌的載玻片上，然后挑取培養(yǎng)皿中菌種的菌絲于瓊脂塊的3個(gè)角上，再蓋上滅過菌的蓋玻片，用記號(hào)筆輕輕敲1下，以免蓋玻片移動(dòng)，在玻片上做好標(biāo)記，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d左右（整個(gè)過程都要保證無菌狀態(tài)）。

1.2.4顯微特征觀察取出培養(yǎng)3 d后的玻片，置于顯微分析儀的操作臺(tái)上，用針尖輕輕挑起蓋玻片的一側(cè)，慢慢地拿起蓋玻片，并輕輕地挑掉周圍的培養(yǎng)基，在新的載玻片中央滴1滴甲基藍(lán)，蓋玻片的一側(cè)先接觸液體，然后慢慢地放下蓋玻片，用濾紙吸取周圍多余液體，置于顯微鏡下觀察，觀察菌絲以及孢子并進(jìn)行拍攝，同時(shí)使用測(cè)微尺測(cè)量孢子的大小（長(zhǎng)和寬都要測(cè)）。每個(gè)菌株的孢子各測(cè)30個(gè)，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5木霉菌發(fā)酵液（相當(dāng)于稀釋10倍）的制備于 500 mL 三角瓶中加入100 mL的PDA液體培養(yǎng)基，包扎，于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，無菌條件下用接種針挑取適量活化木霉菌株的菌絲，接種于三角瓶中的培養(yǎng)基中，置于28 ℃的搖床上150 r/min培養(yǎng)7 d，獲得各菌株的發(fā)酵液，發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min，取上清液，再在無菌狀態(tài)下用022 μm濾膜過濾除菌，濾液分別裝于滅菌錐形瓶中。

1.2.6抑菌效果的測(cè)定將PDA固體培養(yǎng)基加熱至熔化，室溫靜置，待培養(yǎng)基溫度降到60 ℃左右時(shí)，將木霉菌發(fā)酵液與培養(yǎng)基按照體積比1 ∶9充分混勻，混勻后立刻倒平板，在無菌操作臺(tái)上室溫放置至凝固，即制成含發(fā)酵液的平板，以不加發(fā)酵液的PDA平板為對(duì)照。從培養(yǎng)好的4種病原真菌菌落上，用滅過菌的打孔器沿邊緣打出直徑為0.4 cm的圓形菌塊，將菌塊分別轉(zhuǎn)接至已凝固的培養(yǎng)基平板表面，并設(shè)3個(gè)重復(fù)，以無發(fā)酵液平板為對(duì)照，置于25 ℃培養(yǎng)箱下培養(yǎng)3 d。用十字交叉法測(cè)定菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)以下公式計(jì)算抑菌率：抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-發(fā)酵液處理后的菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。endprint

2結(jié)果與分析

2.1木霉菌菌落形態(tài)和顯微形態(tài)描述

供試木霉菌得菌落形態(tài)和孢子等特征見圖1、表1，根據(jù)這些特征初步鑒定，DBs0-13為多孢木霉（T. polysporum）、DBs57為里氏木霉（T. reesei）、DBs66為長(zhǎng)孢木霉（T. longipile）、40號(hào)為綠色木霉（T. viride）、171為康氏木霉（T. koningii）、292為哈茨木霉（T. harizianum）。表1木霉菌相關(guān)形態(tài)特征

2.2供試木霉對(duì)病原真菌的抑制作用

由表2可知，多孢木霉菌DBs0-13和171康氏木霉對(duì)4種病原真菌都有抑菌作用；其他4種木霉菌（DBs57、DBs66、40、292）除對(duì)小麥赤霉病菌沒有抑制作用外，對(duì)其他病原菌也有較強(qiáng)的抑制作用。對(duì)小麥赤霉病菌抑制作用最強(qiáng)的是171；對(duì)蘋果輪紋病菌抑制作用最強(qiáng)的是40，抑菌率為4885%；對(duì)油菜菌核病菌、可可球二孢菌抑制作用最強(qiáng)的是DBs0-13，抑菌率分別為62.89%、41.12%。綜合抑菌結(jié)果可知，在所有供試木霉中DBs0-13的抑菌效果最好，是值得開發(fā)的生防菌。

3結(jié)論

6種內(nèi)生木霉菌對(duì)蘋果輪紋菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，而對(duì)小麥赤霉菌基本上不具有抑制作用（除了DBs0-13和171號(hào)木霉菌），與空白對(duì)照相比成負(fù)抑制狀態(tài)，很有可能對(duì)小麥赤霉菌的生長(zhǎng)反而具有促進(jìn)作用。其中，DBs0-13具有比較高的抑菌率，而且其抑菌范圍較寬，是比較好的生物農(nóng)藥資源，可以作田間試驗(yàn)以進(jìn)一步開發(fā)利用。

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