宮頸癌全外顯組測定及易感基因研究＊

胡 蓉，鐘田雨，陳曉紅

（贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西贛州341000）

宮頸癌是一種在婦女中多發(fā)的惡性腫瘤疾病，其病死率、發(fā)病率僅次于乳腺癌，發(fā)病年齡越來越趨于年輕[1]。發(fā)展中國家宮頸癌的發(fā)病率較高，我國宮頸癌患者約占全球總患者的1／3，且發(fā)病年齡年輕化，對女性的生命健康造成嚴重威脅，必須引起重視。人乳頭瘤病毒（HPV）感染一直被公認為是導致宮頸癌發(fā)病的病因[2-3]，這種病毒的感染引發(fā)宮頸發(fā)生癌前病變，最終引發(fā)為宮頸癌。感染HPV婦女主要集中在青年和中年女性，但其中只有很少的婦女會發(fā)展為癌癥，并且感染的過程需要較長的時間，如果做好預防措施，治愈的可能性很大，因此單獨的HPV感染可能不是導致宮頸癌的主要病因。隨著對基因研究的不斷深入，特別是對基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，在HPV感染發(fā)展到宮頸癌的過程中，基因的多態(tài)性可能起到很大的作用，本研究通過對128例宮頸癌婦女與100例健康婦女微小RNA-96（MiR-96）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、Twist與Slug基因表達水平的對比分析，評估其表達對宮頸癌發(fā)病的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年3月至2014年5月在本院就診的宮頸癌患者128例，為觀察組。其中鱗癌110例（85.9%），腺癌10例（7.8%），腺鱗癌8例（6.3%），年齡22～67歲，平均（45.0±3.4）歲，手術之前均未接受化療或者放療。同時收集同期進行常規(guī)體檢的健康者100例作為對照組，對照組各項化驗指標正常并且無腫瘤史。兩組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HIF-1α表達檢測 采用HIF-1α試劑盒（蘇州普泰生物技術有限公司）對單克隆抗體HIF-1α進行檢測，按照試劑盒要求進行染色及組織標本制備，用顯微鏡對制備組織進行觀察，計數(shù)陽性染色細胞數(shù)。根據(jù)腫瘤細胞染色強度及顯色比例，計算陽性細胞率，大于10%為陽性。

1.2.2 MiR-96表達檢測 將組織標本切成薄片，再研磨成粉末，用Trizol試劑按照Trizol試劑盒（Invitrogen公司）的說明提取總RNA，將RNA進行反轉錄，通過PCR定量檢測MiR-96的相對表達值，其正向引物：5′-TTT GGC ACT AGC ACA TT-3′；反向引物：5′-TTT GGC ACT AGC ACA TT-3′。引物序列長度腫瘤的分期是按照WHO以及國際婦產(chǎn)科協(xié)會（FIGO）的腫瘤分期標準。MiR-96表達以U6參數(shù)，測得到△Ct值，△Ct＝MiR-96平均Ct值-U6平均Ct值，而2-△△Ct就可以反應MiR-96的相對表達情況。

1.2.3Twist與Slug基因表達檢測 將組織標本切成薄片，再研磨成粉末，Trizol試劑盒（Invitrogen公司）提取組織RNA，根據(jù)Twist與Slug基因的序列編號來進行引物的設計，Twist上游引物序列：5′-ACG AGC TGG ACT CCA AGA TG-3′，下游引物序列：5′-GGC ACG ACC TCT TGA GAA TG-3′；Slug上游引物序列：5′-CCT GGT TGC TTC AAG GAC AC-3′，下游引物序列：5′-TCC ATG CTC TTG CAG CTC TC-3′，通過PCR定量檢測Twist與SlugmRNA的相對表達值。TwistmRNA相對表達水平＝Twist拷貝數(shù)／β-actin拷貝數(shù)，SlugmRNA相對表達水平＝Slug拷貝數(shù)／β-actin拷貝數(shù)。

表1 HIF-1α在兩組婦女宮頸組織中的表達結果[n（%）]

1.3 統(tǒng)計學處理 采用數(shù)據(jù)處理軟件包為SPSS16.0，計量資料符合正態(tài)分布、方差齊性的數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α在兩組婦女宮頸組織中的表達 HIF-1α在腫瘤組織中的陽性表達率為75.8%，在正常組織中的表達率為0%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳細見表1。

2.2 MiR-96在兩組婦女宮頸組織中的相對表達值 MiR-96在正常組織的相對表達值為1.01±0.16，在腫瘤組織中為44.56±3.67，在腫瘤組織中的相對表達值遠遠高于正常組織，兩組進行比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；腫瘤組織Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期MiR-96相對表達值分別為15.43±2.01、84.42±7.65、456.32±37.32，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3Twist與Slug基因在兩組婦女宮頸組織中的表達Twist基因在正常組織的相對表達量為（2.02±0.46）×10-3，在腫瘤組織中為（6.54±1.23）×10-3，在腫瘤組織中的相對表達量遠遠高于正常組織，兩組進行比較差異有統(tǒng)計學意義（t＝38.29，P＜0.05）；Slug基因在正常組織的相對表達量為（1.32±0.34）×10-2，在腫瘤組織中為（4.68±1.02）×10-2，在腫瘤組織中的相對表達量遠遠高于正常組織，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t＝34.87，P＜0.05）。

3 討論

宮頸癌是一種在中老年婦女中高發(fā)的癌癥疾病，發(fā)生率有逐年上升的趨勢。HPV病毒感染一直以來被公認為是導致宮頸癌的主要因素，針對此類病毒的疫苗研制取得了重大進展[4]。但隨著人們對宮頸癌疾病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)的病毒感染者會最終發(fā)展為宮頸癌，提示宮頸癌的發(fā)生除了HPV感染導致以外，環(huán)境致癌因素與遺傳因素也可能是導致宮頸癌發(fā)生的主要因素。遺傳因素并不直接導致腫瘤的發(fā)生，但它會改變個體的易感性，并且在特殊的條件下被激發(fā)。

大量研究報道，MiR-96[5]、HIF-1α[6]、Twist與Slug基因表達升高可使患宮頸癌的概率大大提高，宮頸癌發(fā)生與上述基因的表達有很大的關系[7]。MiR-96可能通過調(diào)控參與基因的信號通路，從而導致癌細胞的侵襲能力增強，在這個過程當中MiR-96發(fā)揮了與癌基因類似的功能，間接參與了宮頸癌的發(fā)生[8]；Twist與Slug基因，對宮頸癌的發(fā)生、侵襲，甚至耐藥都有著很大影響，它們的過度表達與乳腺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切[9]。HIF-1α在腫瘤的發(fā)生中起著不可忽視的作用[10]。腫瘤細胞的快速生長勢必會造成腫瘤組織缺氧，HIF-1α在應付組織缺氧方面起著重大作用[11-12]，缺氧情況下HIF-1α上調(diào)，引起多血管的形成[13-14]，細胞適應缺氧的環(huán)境導致腫瘤細胞的繼續(xù)生長、擴散[15]。本研究通過對MiR-96、HIF-1α、Twist與Slug等易感基因在宮頸癌組織及正常組織中的表達水平測定，結果顯示：HIF-1α在正常組織中基本沒有陽性表達，而在腫瘤組織中陽性表達率遠遠高于正常組織；MiR-96在腫瘤組織中的相對表達值遠遠高于正常組織，并且隨著疾病的進展表達量顯著提高；Twist與Slug基因在腫瘤組織中的相對表達量遠遠高于正常組織；兩組進行比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，MiR-96、HIF-1α、Twist與Slug等易感基因均與腫瘤的發(fā)生有關，甚至可能是導致宮頸癌發(fā)生的重要因素。有必要對上述基因進行進一步的研究，為臨床婦科腫瘤的診斷、治療提供一定的科學依據(jù)。

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