血漿激肽釋放酶水平與成人隱匿性自身免疫性糖尿病的關(guān)系＊

秦 雯，覃保瑜，夏 寧

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院：1.病理科2.老年內(nèi)分泌科；3.內(nèi)分泌代謝病科，南寧530021）

世界衛(wèi)生組織將糖尿病視為一種常見(jiàn)的流行病。初步估計(jì)至2015年，在超過(guò)30歲的成年人群中糖尿病的發(fā)病率將增加60%，且高發(fā)年齡將為45～64歲[1]，其中既包括2型糖尿?。═2DM），也包括成人隱匿性自身免疫性糖尿?。╨atent autoimmune diabetes in the adult，LADA），此二者在發(fā)病初期難以鑒別。對(duì)糖尿病進(jìn)行正確分類(lèi)才能做到早期、適當(dāng)治療，降低發(fā)生微血管并發(fā)癥的概率[2-3]。尤其對(duì)于LADA患者，由于其可能會(huì)迅速進(jìn)入胰島β細(xì)胞衰竭和胰島素缺乏期，早期及時(shí)診斷并給予胰島素治療可有效控制血糖，保存剩余β細(xì)胞功能，延緩并發(fā)癥的發(fā)生。目前，在臨床檢驗(yàn)中常通過(guò)一些胰腺自身抗體來(lái)初步鑒別自身免疫性糖尿病。然而這些自身抗體不僅種類(lèi)繁多，而且無(wú)論是陽(yáng)性率還是敏感性在LADA患者中均相對(duì)較低[4]。因此，探索有別于自身抗體的指標(biāo)，更早地預(yù)測(cè)LADA是本研究的目的所在。不少研究報(bào)道都揭示了炎性反應(yīng)在經(jīng)典1型糖尿?。═1DM）和LADA發(fā)病過(guò)程中所起的作用[5-8]。有研究證實(shí)在鏈脲佐菌素制造的T1DM鼠模型中，致炎因子血漿激肽釋放酶（KLKB1）在循環(huán)血中的水平是升高的[9]；而LADA與T1DM同為自身免疫性糖尿病，其血漿中KLKB1水平的變化尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討KLKB1在早期LADA患者血漿中的變化及與早期預(yù)測(cè)LADA的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 各疾病組均選自2011年8月至2011年12月在本院就診的新診斷糖尿病患者，病程均小于1年，收集標(biāo)本前患者均未接受其他治療且知情同意。糖尿病診斷采用2003年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）診斷標(biāo)準(zhǔn)；而LADA的診斷目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用Fourlanos等[10]和周智廣等[11]提出的標(biāo)準(zhǔn)。LADA組58例，其中男32例，女26例，平均年齡（37.22±5.08）歲，平均病程（4.81±1.12）個(gè)月。T1DM 組52例，其中男28例，女24例，平均年齡（12.19±3.80）歲，平均病程（4.52±1.23）個(gè)月。T2DM 組65例，其中男37例，女28例，平均年齡（38.23±4.73）歲，平均病程（4.68±1.23）個(gè)月。各組受檢者的年齡、性別構(gòu)成及病程間有均衡性。另選同期健康自愿者83例為健康對(duì)照組（NC組），其中男48例，女35例，平均年齡（36.84±4.66）歲。

表1 各組一般臨床資料及生化指標(biāo)比較（±s）

表1 各組一般臨床資料及生化指標(biāo)比較（±s）

-：無(wú)數(shù)據(jù)；a：P＜0.05，與LADA組比較。

）]LADA組 58 32／26 37.2±5.1 4.8±1.1 8.2±0.8 9.2±1.7 15.8±1.5 0.71（0.63，0.76） 1.3±0.2 58（100）組別 n 性別（男／女）年齡（歲）病程（月）HbA1c（%）FPG（mmol／L）2hPG（mmol／L）FCP[M（P25，P75），ng／mL]2hCP（ng／mL）GADA[n（%T1DM 組 52 28／24 12.2±3.8a4.5±1.2 8.6±0.8a10.0±1.6a17.0±1.9a0.53（0.43，0.65）a1.0±0.2a52（100）T2DM 組 65 37／28 38.2±4.7 4.7±1.2 7.8±0.7a9.0±1.2 13.8±0.8a1.87（1.65，2.16）a6.0±1.5a0（0）a NC組 83 48／35 36.8±4.7 - 5.1±0.4a5.1±0.7a 6.1±1.1a1.48（1.25，1.79）a5.6±1.9a0（0）a

1.2 方法 晨起抽空腹血查空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹C肽水平（FCP），進(jìn)食100g饅頭后2h抽查餐后2h血糖（2hPG）、餐后2hC肽（2hCP）。FPG、2hPG采用西門(mén)子公司ADVIA2400全自動(dòng)生化儀葡萄糖氧化酶法測(cè)定。FCP、2hCP的檢測(cè)使用美國(guó)DPC公司全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（IMMULATE-1000），采用化學(xué)發(fā)光法。HbA1c采用Bio-Rad公司全自動(dòng)糖化血紅蛋白儀高效液相法檢測(cè)。另留2份血樣，分離血漿，-80℃保存，1份用于谷氨酸脫羧酶抗體（glutamic acid decarboxylase，GADA）的測(cè)定（ELISA法，北京北方生物技術(shù)研究所），1份用于KLKB1的測(cè)定（ELISA法，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料予以正態(tài)性檢驗(yàn)，對(duì)符合正態(tài)分布變量表示為±s，LADA組與其他各組KLKB1值組間比較采用單因素方差分析；對(duì)非正態(tài)分布變量用百分位數(shù)表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；血漿KLKB1和其他指標(biāo)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，多因素分析采用多元線性回歸法（逐步法）；使用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析血漿KLKB1對(duì)LADA臨床早期診斷的意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 LADA組與其他各組在性別構(gòu)成、病程（NC組除外）方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LADA組與其他各組（T1DM組除外）在年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LADA組與其他各組的FPG（T2DM 組除外）、2hPG、HbA1c、FCP、2hCP指標(biāo)方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LADA組與其他各組（T1DM組除外）GADA的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 血漿KLKB1水平在各組中的比較 血漿KLKB1在LADA組中的值為（29.44±7.22）μg／mL，明顯高于 T2DM 組的（24.76±6.88）μg／mL和 NC組的（25.61±6.86）μg／mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)也高于T1DM 組的（28.27±7.86）μg／mL，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 LADA組患者血漿KLKB1水平相關(guān)因素分析 經(jīng)Spearman相關(guān)分析，LADA組血漿KLKB1含量與年齡、病程、2hCP無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），與FCP呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與 HbA1c、FPG、2hPG呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。進(jìn)一步以 KLKB1為因變量，以年齡、病程、FPG、2hPG、HbA1c、FCP、2hCP各項(xiàng)指標(biāo)為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，僅有病程、FCP進(jìn)入回歸方程（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 KLKB1與其他觀察指標(biāo)的Spearman相關(guān)分析結(jié)果

表3 以KLKB1為因變量的多元線性回歸分析

2.4 血漿KLKB1值早期預(yù)測(cè)LADA的靈敏性、特異性及臨界值探討 為證實(shí)血漿KLKB1值在鑒別LADA和T2DM中的價(jià)值，繪制ROC曲線。同時(shí)，計(jì)算出其預(yù)測(cè)LADA的靈敏度、特異度和臨界值。經(jīng)計(jì)算，血漿KLKB1預(yù)測(cè)LADA的臨界值為20.60μg／mL，靈敏度為0.88，特異度為0.38，見(jiàn)圖1。

圖1 KLKB1預(yù)測(cè)LADA的ROC曲線

3 討論

目前診斷LADA的直接證據(jù)是檢測(cè)到血液中與之相關(guān)的多種自身免疫抗體，如胰島細(xì)胞質(zhì)抗體、胰島細(xì)胞表面抗體、胰島素自身抗體、GADA等[12]。間接證據(jù)有標(biāo)志胰島β細(xì)胞功能的胰島素及C-肽水平的降低。然而有研究顯示，即使是T2DM患者，其胰島自身免疫抗體也有17.21%的陽(yáng)性率[13]。胰島素因在肝腎內(nèi)分解且半衰期短而影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，不少患者在LADA的發(fā)病初期C肽值無(wú)明顯變化，這些都導(dǎo)致了LADA的誤診或漏診。

KLKB1是一種由激肽釋放酶原產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，也是由KLKB1基因表達(dá)的一種豐富的循環(huán)酶原。它本質(zhì)上是一種水解酶，作用于肽鍵，也就是絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶。它所參與的補(bǔ)體及凝集通路是血漿中一連串蛋白水解的串聯(lián)通路，是針對(duì)病原體的非特異性防御機(jī)制。補(bǔ)體的激活有3條路徑：經(jīng)典路徑、外源凝集素路徑和替代路徑，所有路徑產(chǎn)生決定性的酶活性，并依次產(chǎn)生補(bǔ)體效應(yīng)分子。補(bǔ)體激活的主要結(jié)果是產(chǎn)生了調(diào)理素，補(bǔ)充炎性細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞。KLKB1所參與的生物過(guò)程除了經(jīng)典的血液凝固過(guò)程、纖溶過(guò)程、止血過(guò)程外，還有炎性反應(yīng)過(guò)程。因此，它在許多疾病中都有致炎因子的作用，而這一方面通常被研究者們忽略。所以有學(xué)者認(rèn)為有必要評(píng)估KLKB1在胰島炎及在最終發(fā)展成T1DM過(guò)程中的作用[14-15]。

最近對(duì)KLKB1的基因?qū)W、分子學(xué)和藥理學(xué)研究使人們對(duì)其生理和病理角色有了更深入的理解?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)KLKB1的變構(gòu)體與血液中的代謝物水平、高血壓和凝集作用有關(guān)。以KLKB1基因缺陷為特征的動(dòng)物模型和KLKB1抑制物都已證實(shí)了其在炎癥、血管功能、血壓調(diào)節(jié)、血栓形成、糖尿病和代謝等方面的作用[16-17]。

本研究通過(guò)對(duì)LADA組與T1DM組、T2DM組、NC組的血漿KLKB1水平對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，KLKB1在LADA組與T1DM組中的絕對(duì)定量值非常相近，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)兩者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而血漿KLKB1水平在LADA組與T2DM組、NC組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在LADA組中呈明顯上調(diào)的趨勢(shì)。有很多自身免疫性疾病發(fā)病的早期常有炎性反應(yīng)的表現(xiàn)，如鏈球菌感染后的急性腎小球腎炎發(fā)病早期，在能檢測(cè)出自身抗體前其補(bǔ)體水平就已明顯下降。對(duì)于T1DM和LADA的發(fā)病機(jī)制，目前已知它們都屬于自身免疫性疾病，而這些自身抗體產(chǎn)生的真正原因并未闡明，是否有炎癥因素參與到疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)尚無(wú)定論。本研究中血漿KLKB1水平在早期LADA和T1DM患者中上調(diào)提示，炎癥因素很可能在疾病的早期已經(jīng)開(kāi)始發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)LADA組血漿KLKB1水平的相關(guān)因素分析和多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CP是LADA組血漿KLKB1水平的主要影響因素，而FCP又是反映患者糖代謝及胰島β細(xì)胞功能的重要指標(biāo)，這就從一個(gè)側(cè)面證實(shí)KLKB1極有可能參與了LADA的病理生理過(guò)程。據(jù)此推測(cè)，糾正KLKB1過(guò)高的狀態(tài)有可能使LADA患者獲益，但該設(shè)想尚需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。由于KLKB1在LADA發(fā)病的初期就已經(jīng)升高了，本研究采用ROC曲線進(jìn)一步分析KLKB1是否能作為早期預(yù)測(cè)LADA的指標(biāo)，結(jié)果顯示KLKB1蛋白對(duì)LADA的早期診斷預(yù)測(cè)性一般，故單獨(dú)應(yīng)用KLKB1對(duì)LADA進(jìn)行診斷或鑒別診斷具有較大局限性。

綜上所述，KLKB1對(duì)判斷LADA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷LADA有一定意義，可在LADA高危人群中結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行篩選、監(jiān)控。如果在KLKB1升高的同時(shí)發(fā)現(xiàn)胰島素、FCP等指標(biāo)異常，應(yīng)及早干預(yù)治療，盡量保護(hù)殘留的胰島β細(xì)胞，阻止或延緩LADA的發(fā)生。此外，由于本研究樣本含量有限，尚需從分子水平進(jìn)一步探明KLKB1在LADA發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

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