銜接蛋白AP-2在不同發(fā)育時期小鼠耳蝸毛細(xì)胞中的表達(dá)*

顧翔陳知己蔡婷宋銳周小清袁偉

1第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(重慶　400038)

銜接蛋白AP-2在不同發(fā)育時期小鼠耳蝸毛細(xì)胞中的表達(dá)*

顧翔1陳知己1蔡婷1宋銳1周小清1袁偉1

1第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(重慶400038)

【摘要】目的通過檢測不同發(fā)育階段小鼠耳蝸毛細(xì)胞銜接蛋白AP-2蛋白的表達(dá)，初步探討其在聽覺發(fā)生、形成中的作用。方法選用出生后7日(P7)、15日(P15)、35日(P35)及16月齡小鼠各20只，分別代表新生小鼠、聽覺發(fā)育階段小鼠、聽覺發(fā)育成熟小鼠及老年小鼠，對其進行ABR檢測，用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察各發(fā)育階段小鼠耳蝸AP-2蛋白的定位與表達(dá)，用qRT-PCR技術(shù)檢測小鼠耳蝸AP-2基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果P15、P35及16月齡小鼠ABR反應(yīng)閾分別為18.67±1.21、13.83±1.47、37.83±7.68 dB nHL，P7組小鼠未引出反應(yīng)波形。在小鼠內(nèi)耳發(fā)育不同階段均有不同程度的AP-2蛋白表達(dá)，主要定位于耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞胞漿，集中表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞基底部與帶狀突觸靠近傳入神經(jīng)元區(qū)域，P7、P15、P35及16月齡組小鼠耳蝸AP-2蛋白熒光染色密度值分別為190.91±17.27、494.06±27.63、838.41±38.23和682.65±72.22; AP-2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.53±0.09、1.03±0.02、1.00±0.09和1.03±0.06;與新生小鼠相比較，隨小鼠聽覺的產(chǎn)生和形成，耳蝸AP-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P＜0.01 )，免疫熒光染色提示老年性聾小鼠AP-2蛋白在內(nèi)毛細(xì)胞的表達(dá)量較P35小鼠減少(P＜0.05)，但qRT-PCR分析AP-2基因mRNA的表達(dá)水平與成熟小鼠(P15)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論在小鼠聽覺發(fā)育成熟階段，隨小鼠日齡增加耳蝸AP-2蛋白表達(dá)逐漸增強，提示AP-2蛋白的表達(dá)水平可能與聽覺的發(fā)生、形成和維持密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】銜接蛋白;內(nèi)毛細(xì)胞;年齡相關(guān)性聽力損失;小鼠

*國家自然科學(xué)基金(81470694，30973301，81271080)、重慶市自然基金(CSTC2009BB5170)聯(lián)合資助

耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸是進行聲音編碼的解剖和功能的基本結(jié)構(gòu)，聽覺的產(chǎn)生與維持依賴于此內(nèi)毛細(xì)胞突觸活性區(qū)域(active zones，AZs)釋放神經(jīng)遞質(zhì)，由此完成機械-電換能作用［1］。突觸囊泡與突觸前膜融合釋放神經(jīng)遞質(zhì)進行聽信號的傳遞，但是如果沒有有效的胞吞作用，細(xì)胞膜就會因為囊泡的胞吐而不斷擴大，從而影響正常的突觸循環(huán)。因此，突觸囊泡膜的回收利用對囊泡池的補充和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放具有重要意義［2，3］。目前研究認(rèn)為，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin mediated endocytosis，CME)是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞突觸活性區(qū)域遞質(zhì)釋放后囊泡回收的重要途徑［4，5］，而銜接蛋白AP-2(adaptin-2，AP -2)通過綁定不同蛋白分子從結(jié)構(gòu)和動力的層面參與了此囊泡回收過程［6，7］，AP-2對網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的突觸囊泡胞吞過程具有重要意義。

出生后第10～14天是小鼠聽覺開始出現(xiàn)的時期［8，9］，聽覺的產(chǎn)生與耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸囊泡的有效循環(huán)密切相關(guān)，聽覺形成前后是否伴隨著內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡內(nèi)吞功能的變化，小鼠聽覺的發(fā)生和形成與調(diào)控內(nèi)吞的關(guān)鍵分子AP-2蛋白之間是否存在關(guān)聯(lián)尚不清楚，研究AP-2蛋白在不同發(fā)育階段耳蝸毛細(xì)胞的動態(tài)變化對于研究內(nèi)毛細(xì)胞內(nèi)吞的相關(guān)功能具有重要意義。前期研究顯示AP-2蛋白與內(nèi)毛細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，AP-2蛋白主要定位于耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞胞漿，集中表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞基底部與帶狀突觸靠近傳入神經(jīng)元區(qū)域［10］。本研究擬通過觀察出生后不同發(fā)育階段(postnataldevelopment) (P7、P15、P35)以及老年小鼠(16月齡)聽功能及銜接蛋白AP-2的定位與表達(dá)特點，探討AP-2蛋白與聽覺發(fā)生發(fā)育和老年性聽力減退的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組隨機選取7日齡(P7)、15日齡(P15)、35日齡(P35)及16月齡昆明小鼠各20 只(40耳)，為排除雌激素對聽力的影響，均選用雄性小鼠;耳廓反射靈敏，無噪聲暴露及用藥史。各組10只動物用于免疫熒光染色，10只用于qRTPCR。

1.2實驗方法

1.2.1 ABR檢測所有測試均在第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院聽力檢測隔聲屏蔽室內(nèi)進行。采用Nicolet compass測試系統(tǒng)，5%水合氯醛(0.7 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，將小鼠固定于ABR測試盒內(nèi)，將針形記錄電極置于顱頂，參考電極置于雙側(cè)耳廓，地極置于鼻尖，電極阻抗及極間電阻均小于≤5 kΩ。雙耳交替給聲。刺激聲為短聲(click)，刺激速率為23.1次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，分析時間10 ms，疊加1 024次。刺激聲強度從90 dB nHL開始，先以10 dB遞減，然后以5 dB遞減，以能分辨出波Ⅱ的最低刺激強度為閾值，并重復(fù)2次。

1.2.2小鼠耳蝸固定分離檢測ABR閾值后斷頸處死小鼠，取出顳骨，去除腦組織，將兩側(cè)聽泡置于盛有4%多聚甲醛的玻璃皿中;迅速分離耳蝸，以顯微鑷刺破卵圓窗，開放圓窗，于蝸頂處鉆一小孔，以1 ml注射器于蝸頂小孔緩慢注入4%多聚甲醛，反復(fù)3次，將灌流固定好的耳蝸置于盛有4%多聚甲醛中4℃過夜。取出固定后的耳蝸置于盛有PBS緩沖液的玻璃皿中，逐步去除蝸殼，撕去前庭膜、蓋膜及血管紋，充分游離基底膜，選取耳蝸基底膜中回進行免疫熒光染色。

1.2.3免疫熒光染色方法將耳蝸基底膜置于0.5% Triton X-100中打孔20分鐘，PBS溶液漂洗(3次，每次5分鐘)，在1: 200驢血清室溫下封閉2小時，然后加入一抗anti-Adaptin α(1: 50，PBS溶液稀釋)置于4℃冰箱過夜。第二天取出標(biāo)本，PBS溶液漂洗(3次，每次5分鐘)，加入二抗驢抗鼠IgG (1: 500，PBS溶液稀釋)，室溫下(25℃)避光染色45分鐘，再以PBS溶液漂洗(3次，每次5分鐘)，加Dapi反應(yīng)10分鐘后PBS溶液漂洗(3次，每次5分鐘)。采用鋪片方式，將耳蝸中回基底膜平鋪于載玻片上，滴加兩滴抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，將玻片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡觀察激光共聚焦顯微鏡下觀察及拍照，激發(fā)光波長FITC 488 nm，Alex 594 nm，檢測器紅光增益均為655，對所觀察區(qū)域的內(nèi)毛細(xì)胞從上而下進行掃描，分別對標(biāo)本的各層圖像進行連續(xù)觀察。掃描層設(shè)定為1 μm，觀察各階段小鼠AP-2蛋白的表達(dá)。

1.2.5 AP-2蛋白免疫熒光強度軟件分析采用ZEN lite 2012軟件(ZEISS)檢測AP-2蛋白免疫熒光Intensity Mean Value(IMV)。軟件隨機截取并檢測所選細(xì)胞熒光區(qū)域等面積IMV，得到四組共40個數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(t檢驗)。

1.2.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分離小鼠耳蝸去除血液及多余骨質(zhì)置于液氮中冷卻，并于RNAiso Plus液中迅速研磨粉碎，Trizol法提取各組總RNA，分光光度儀檢測標(biāo)本RNA濃度及純度。采用前述逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA置于-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄引物由上海生工軟件設(shè)計并制作。上下游引物分別為AP2a2: CAATCCACAGCAAGAAGTGC (前)，AP2a2: GCAACAAGCAGCCAATCTG(后)，應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqⅡ(TliRNase H Plus)于熒光定量PCR儀行qRTPCR，以β-actin為內(nèi)參基因，95℃預(yù)變性10 min，開始循環(huán): 95℃15 s，60℃30 s，72℃50 s，72℃5 s擴增40個循環(huán)后，分析重復(fù)實驗數(shù)據(jù)，分別得出mRNA的CT值。分析相關(guān)參數(shù)后，表達(dá)水平的比較參考Livak方法［11］計算相對表達(dá)量(relative quantity，RQ)值，RQ=2^-ΔΔCt，以P35 mRNA表達(dá)水平作為對照組，比較不同組標(biāo)本與對照組RQ值差異。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同發(fā)育時期小鼠ABR檢測結(jié)果P15、P35、16月齡小鼠ABR反應(yīng)閾分別為18.67±1.21、13.83±1.47和37.83±7.68 dB nHL，P7組小鼠未引出反應(yīng)波形。16月齡組ABR反應(yīng)閾明顯高于P15組和P35組小鼠(P＜0.05) (表1)。

2.2不同發(fā)育階段小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞AP-2蛋白的表達(dá)與蛋白免疫熒光強度分析結(jié)果免疫熒光染色激光共聚焦發(fā)現(xiàn)，AP-2蛋白在小鼠內(nèi)耳不同發(fā)育階段均有不同程度的表達(dá)，主要定位于耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞胞漿，集中表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞突觸活化區(qū)域(圖1)，其中P7組AP-2蛋白熒光強度較弱，但內(nèi)毛細(xì)胞胞質(zhì)中亦可見均一分布的紅色熒光染色(圖1a) ; P7、P15、P35及16月齡組小鼠內(nèi)毛細(xì)胞熒光染色光密度值分別為190.91±17.27、494.06±27.63、838.41±38.23和682.65±72.22，可見，隨小鼠聽覺的產(chǎn)生和逐漸形成，P7、P15和P35組耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞AP-2蛋白表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，16月齡組AP-2蛋白表達(dá)量較P35組減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01) (表1)。

2.3各組小鼠AP-2蛋白表達(dá)量比較變化P7、P15、P35及16月齡組mRNA相對表達(dá)量分別為0.53±0.09、1.03±0.02、1.00±0.09和1.03±0.06。各組相對于P35組AP-2蛋白mRNA的相對表達(dá)量RQ值的變化見表1，可見，P7組AP-2蛋白mRNA相對表達(dá)量RQ值低于P15組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而P15組、16月齡組AP-2蛋白mRNA相對表達(dá)量RQ值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05) (表1)。

表1　各組小鼠ABR反應(yīng)閾、AP-2蛋白免疫熒光光密度值及AP-2mRNA相對表達(dá)量(珋±s)

表1　各組小鼠ABR反應(yīng)閾、AP-2蛋白免疫熒光光密度值及AP-2mRNA相對表達(dá)量(珋±s)

注: IMV選取的單個測量面積為9 μm2; RQ值=2^-ΔΔCt，*與對照組比較，P＜0.05

組別　ABR反應(yīng)閾(dB nHL)免疫熒光光密度值IMV AP-2mRNA相對表達(dá)量RQ值P7組-　190.91±17.27　0.53±0.09*P15組　18.67±1.21　494.06±27.63　1.03±0.02 P35組　13.83±1.47　838.41±38.23　1.00±0.09 16月齡組37.83±7.68　682.65±72.22　1.03±0.06

3　討論

參與和調(diào)控CME過程的AP-2蛋白是一個異源四聚體，由α、β2、μ2和σ2亞基組成，AP-2蛋白是內(nèi)吞所形成的網(wǎng)格蛋白包被小泡的結(jié)構(gòu)核心，在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和突觸囊泡的回收利用中發(fā)揮著重要作用［6，7，12］。因為AP-2的α亞基是蛋白的重要組成部分，α亞基附件區(qū)域通過DPF/W信號與多種調(diào)控蛋白和輔助蛋白(如Amphiphysins、Espsin、Eps15、Auxilin、AP180等)結(jié)合，共同參與網(wǎng)格蛋白包被小泡的形成;當(dāng)α亞基附件區(qū)域表達(dá)異常時，能阻止輔助蛋白的綁定，從而影響內(nèi)吞過程。故本研究用AP-2蛋白2亞基mRNA進行AP-2表達(dá)的PCR研究。

研究發(fā)現(xiàn)正常生理刺激條件下網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(CME)途徑是小鼠內(nèi)毛細(xì)胞突觸囊泡回收的主要方式［5］。目前關(guān)于參與調(diào)控CME途徑的AP-2蛋白在內(nèi)耳的knockdown或knockout模型尚未見報道，本課題組前期通過免疫熒光激光共聚焦顯微鏡定位AP-2蛋白的形態(tài)學(xué)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)聽功能正常成年小鼠AP-2蛋白定位于耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞胞漿內(nèi)，主要表達(dá)于內(nèi)毛細(xì)胞基底部與帶狀突觸靠近傳入神經(jīng)元區(qū)域［10］，而此區(qū)域正是聽覺神經(jīng)通路第一級突觸，快速、不間斷地釋放囊泡為該突觸區(qū)別于其他突觸的顯著特征。本研究發(fā)現(xiàn)，AP-2蛋白持續(xù)表達(dá)于新生至老年各階段小鼠內(nèi)毛細(xì)胞，證明AP-2蛋白在聽覺的發(fā)育和維持方面起著重要作用。

從文中結(jié)果可見，新生小鼠(P7)、發(fā)育階段小鼠(P15)和聽覺成熟小鼠(P35)的耳蝸形態(tài)結(jié)構(gòu)與內(nèi)外毛細(xì)胞均排列整齊，無明顯缺失，但聽功能卻存在差異，P7組小鼠未引出ABR波形，P15組小鼠ABR反應(yīng)閾為18.67±1.21 dB nHL，P35為13.83 ±1.47 dB nHL。這可能與傳遞神經(jīng)遞質(zhì)的第一級神經(jīng)元即耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞突觸仍在繼續(xù)發(fā)育并進行精確的連接有關(guān)。聽覺形成的前、后兩個階段，即P7組與P15組比較，隨小鼠聽覺的產(chǎn)生和形成，后者的AP-2蛋白免疫熒光染色I(xiàn)MV值和AP-2mRNA相對表達(dá)量RQ值均明顯升高(P＜0.05)，而P7小鼠的ABR反應(yīng)閾尚不能引出，可能是因為發(fā)育不成熟的耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞突觸釋放的谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)不能有效的被突觸前膜內(nèi)吞回收，從而影響了突觸囊泡循環(huán)，神經(jīng)遞質(zhì)不能持續(xù)傳遞。隨著小鼠內(nèi)耳的發(fā)育，內(nèi)毛細(xì)胞突觸部位囊泡的內(nèi)吞回收功能逐漸完善，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的谷氨酸受體內(nèi)吞途徑保證了囊泡從突觸前膜回收至胞內(nèi)，參與新一輪囊泡的形成和再生，從而建立完整的突觸囊泡循環(huán)，使得谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)在聽覺傳導(dǎo)通路能正常傳遞，故P15小鼠聽覺已漸趨成熟。

圖1　各組小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞AP-2蛋白的表達(dá)

老年性聾是指隨著年齡增加逐漸出現(xiàn)的聽力下降，是多機制多途徑共同作用所致，與脂質(zhì)過氧化損傷、聽覺中樞退化等有關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，16月齡小鼠ABR反應(yīng)閾明顯高于P35組小鼠，16月齡組小鼠AP-2蛋白表達(dá)量較P35組小鼠減少(P＜0.05)，然而，兩組間AP-2 mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異(P＞0.05)，說明在老年性聾小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)突觸囊泡胞吞作用的功能性AP-2蛋白不足，從而影響了囊泡的內(nèi)吞回收，造成了谷氨酸在內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)突觸部位聚集，產(chǎn)生神經(jīng)興奮性毒性，最終造成聽覺損傷。推測雖然老年性聾小鼠AP-2蛋白的數(shù)量減少可能不明顯，但是失去了部分功能，相關(guān)機制有待通過膜片鉗電生理手段進行更全面的揭示。AP-2蛋白在年齡相關(guān)性聽力損失中可能起著更多作用，需要進一步的研究。

目前對于AP-2蛋白在內(nèi)毛細(xì)胞突觸區(qū)域調(diào)控網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)突觸囊泡內(nèi)吞功能方面的機制尚不清楚，后續(xù)研究可以運用膜片鉗技術(shù)，檢測蛋白抑制劑作用后毛細(xì)胞膜電容的改變及其與聽功能改變的相關(guān)性，也可以運用RNA干擾技術(shù)使耳蝸內(nèi)AP-2 mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，再檢測聽功能有無改變。本實驗通過對不同生長發(fā)育階段小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞AP-2蛋白表達(dá)的研究，初步發(fā)現(xiàn)AP-2蛋白的表達(dá)水平可能與聽覺的發(fā)生、形成和維持密切相關(guān)。隨著對AP-2蛋白的研究深入，將更有助于深入了解聽覺信號傳導(dǎo)通路，從而更深入探討感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制。

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(2015-02-25收稿)

(本文編輯雷培香)

·實驗研究·

Expression of Adaptin-2 in Different Stages of Mouse Cochlea

Gu Xiang，Chen Zhiji，Cai Ting，Song Rui，Zhou Xiaoqing，Yuan Wei
(Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing，400038，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of adaptin-2(AP-2) in different stages of mouse cochlea and its probable role in the auditory generation and formation.Methods Mice were divided into 4 experimental groups by age (7 days old，15 days old，35 days old，16 months old)，which respectively represented the newborn mice，developmental mice，mature mice and old mice.Auditory brainstem response (ABR)，laser scanning confocal microscopy (LSCM)，immune-fluroscence histochemistry and qRT-PCR were used in this study.Results For the 15 days old，35 days old，16 months old groups，ABR average threshold was 18.67±1.21 dB nHL，13.83±1.47 dB nHL，37.83±7.68 dB nHL，respectively，for the 7 days old groups no responses were observed.The AP-2 immunoreactivity was found in all the stages of mice cochlea inner hair cell (IHC) cytoplasm，especially in IHC basal part，nearby the ribbon synapse.For the 7 days old，15 days old，35 days old，16 months old groups，immune-fluroscence histochemistry IMV(intensity mean value) were 190.91±17.27，494.06±27.63，838.41±38.23，682.65±72.22，respectively.For the 7 days old，15 days old，35 days old，16 months old groups，mRNA RQ(relative quantity)book=608,ebook=45were 0.53±0.09，1.03±0.02，1.00±0.09，1.03±0.06，respectively.Developmental mice expressed significantly higher than those of the newborn in the AP-2 protein expression level which was measured by immuno-fluorescence histochemistry and qRT PCR(P＜0.01).There was no significant difference between old and mature mice in the AP-2 protein expression level measured by qRT PCR (P＞0.05)，but mature mice had significant advantages by immuno-fluorescence histochemistry.Conclusion AP-2 protein expression level may closely related to the auditory formation and maintenance because its expression gradually increases with age in mice.

【Key words】Adaptin; Inner hair cell; Age-related hearing loss; Mice

通訊作者:袁偉(Email: weiyuan175@ sina.com)

作者簡介:顧翔，男，湖北人，碩士研究生，主要研究方向為耳科學(xué)。

【中圖分類號】R764.45+6

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1006-7299(2015) 06-0607-05

DOI:10.3969/j.issn.1006-7299.2015.06.010

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-9-10 16: 47

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20150910.1647.034.html