茶多酚對大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨氧化損傷的保護(hù)作用

嚴(yán) 斌 余 非 王立勝 韓士英.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 58000；.廣東醫(yī)學(xué)院附屬西鄉(xiāng)人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 58000；.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東廣州 50080

茶多酚對大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨氧化損傷的保護(hù)作用

嚴(yán) 斌1余 非2王立勝2韓士英3
1.廣東省深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 518000；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬西鄉(xiāng)人民醫(yī)院骨科，廣東深圳 518000；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東廣州 510080

目的探討茶多酚對大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨氧化損傷的保護(hù)作用，以進(jìn)一步了解茶多酚攝入機(jī)體對骨折早期愈合的影響機(jī)制。方法選取3～4月齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠45只作為觀察對象，隨機(jī)將其分為A、B、C三組，每組15只。各組均制造骨折前茶多酚生物效應(yīng)，對三組大鼠進(jìn)行皮下注射，A組劑量為5 mg/（kg·d）茶多酚，B組劑量為10 mg/（kg·d）茶多酚，而C組劑量為0.5 mL/（kg·d）生理鹽水；注射3周后，將每只大鼠橈骨中下1/3交界處造成左側(cè)橈骨3 mm完全骨質(zhì)缺損的骨折模型，不固定；骨折后繼續(xù)注射茶多酚，制造骨折后茶多酚生物效應(yīng)；采用HE染色分別觀察大鼠在骨折愈合不同時期（造模后3、7、14、21 d）的骨痂厚度及骨痂成熟度。 結(jié)果①骨痂厚度：經(jīng)HE染色觀察，造模后3 d，三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后7 d，B組明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后14 d，A組與B組明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后21 d，B組明顯高于A組與C組，且A組明顯高于C組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②A組與B組大鼠術(shù)后3 d即可見到骨內(nèi)外膜開始增厚，術(shù)后7 d骨折端肉芽組織形成，術(shù)后14 d骨折端肉芽組織開始重新生長，術(shù)后21 d骨折端纖維性骨痂與纖維母細(xì)胞有明顯減少；C組術(shù)后3、7 d骨內(nèi)外膜也有所增厚，但是與術(shù)前相比差異不明顯，術(shù)后14、21 d骨痂中纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管密度及纖維性結(jié)締組織有明顯增加，出現(xiàn)新生血管，但是成骨細(xì)胞的增殖數(shù)量與A、B組相比明顯偏低，而且骨痂的成熟度也相對較低，內(nèi)外骨痂改造塑形期出現(xiàn)較晚。 結(jié)論茶多酚對骨關(guān)節(jié)軟骨氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，其可以通過促進(jìn)骨痂增殖分化，增加骨痂含量，加快骨痂的成熟，從而提高骨折的愈合速度。

茶多酚；骨關(guān)節(jié)軟骨；氧化損傷；保護(hù)；腫瘤壞死因子

骨折后形成的骨癡組織對骨的修復(fù)、愈合過程至關(guān)重要，也是骨折愈合程度的評定標(biāo)準(zhǔn)［1-2］。茶多酚對機(jī)體細(xì)胞和組織具有復(fù)雜的生物效應(yīng)，本課題擬采用動物實(shí)驗(yàn)方法研究茶多酚對大鼠骨折愈合的影響，通過建立茶多酚生物效應(yīng)下的骨折愈合模型，使用HE染色法檢測骨痂厚度及成熟度，使用免疫組化染色法檢測骨痂中腫瘤壞死因子（TNF-α）表達(dá)水平來探討茶多酚對骨折愈合的早期影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取3～4月齡健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠45只，作為本組研究的觀察對象，隨機(jī)將其分為A、B、C三組，每組15只。入選標(biāo)準(zhǔn)［3］：SPF級SD大鼠；雄性；7周齡，體重（260±20）g，避免大齡大鼠骨折后愈合差對實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.2 方法

A、B、C三組均制造骨折前茶多酚生物效應(yīng)，對三組大鼠進(jìn)行皮下注射，A組劑量為5 mg/（kg·d）茶多酚，B組劑量為10 mg/（kg·d）茶多酚，而C組劑量為0.5 mL/（kg·d）生理鹽水；注射3周后，將每只大鼠橈骨中下1/3交界處造成左側(cè)橈骨3 mm完全骨質(zhì)缺損的骨折模型，不固定；骨折后繼續(xù)注射茶多酚，制造骨折后茶多酚生物效應(yīng)。采用HE染色分別觀察大鼠在骨折愈合不同時期（造模后3、7、14、21 d）的骨痂厚度及骨痂成熟度［4］。

1.2.1 主要設(shè)備與試劑 Leica-SPl600型鋸齒切片機(jī)（德國/型號Leica徠卡，上海仁科生物科技有限公司進(jìn)口）、DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱 （型號：DHG-9145A，上海一恒科技有限公司生產(chǎn)）、CA950-2超凈臺 （蘇州安泰凈化儀器廠生產(chǎn)）、冰箱 （青島海爾）、TGL-16C臺式離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)）、倒置相差熒光顯微鏡（美國Olympus公司生產(chǎn)）、流式細(xì)胞儀 （美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)，型號：EPICSRALTRA）、酶標(biāo)記儀（美國Bio-RAD公司生產(chǎn)，型號：Bio-rad680）、可調(diào)式微量移液儀 （法國Gilson公司，型號：吉爾森F123603）、電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠生產(chǎn)）、隔水式電熱恒溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、手術(shù)刀片（上海醫(yī)療器械公司生產(chǎn)）、蚊氏血管嵌（上海醫(yī)療器械公司生產(chǎn)）、持針器（上海醫(yī)療器械公司生產(chǎn)）、5 mL注射器針頭［碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司生產(chǎn)］。

1.2.2 影像學(xué)檢查 所有大鼠均取俯臥位，用膠帶固定在解剖臺板上，經(jīng)足量致死量麻醉處死后（目前實(shí)驗(yàn)中常用的大鼠處死方法有脊椎脫臼法、擊打法、斷頭法、急性大失血法及空氣栓塞法等，但操作過于復(fù)雜，而且大鼠痛苦較大，因此本組實(shí)驗(yàn)采用腹腔內(nèi)注射過量麻藥的處死方法，保證實(shí)驗(yàn)動物在影像學(xué)檢查中保持安靜），行術(shù)側(cè)股骨干側(cè)位X線拍片，將X線機(jī)攝片放大比例、投射燈與術(shù)側(cè)股骨干的垂直距離調(diào)為一致，拍片后準(zhǔn)確記錄拍攝時間并妥善保存。

1.2.3 標(biāo)本取材 X線拍片后，開始對術(shù)側(cè)股骨干標(biāo)本進(jìn)行取材，取材范圍為近端完整股骨頭至遠(yuǎn)端股骨髁的股骨干全長，包括近端股骨頭，遠(yuǎn)端股骨髁，不包括髕骨，并將髓腔內(nèi)柯氏針拔除，用組織剪盡可能去除肌肉等軟組織僅保留股骨干，操作時動作要輕，避免粗暴致使新生骨痂遭到破壞，修剪后用清水將殘屑及殘留的組織沖洗干凈進(jìn)行濕重稱量［5］。標(biāo)本稱重后對于其進(jìn)行修整，由于標(biāo)本硬度較高，在處理時要避免由于用力過猛人為導(dǎo)致二次骨折的發(fā)生。修整完成后再次用清水對標(biāo)本進(jìn)行徹底沖洗，并浸泡于固定液（10%甲醛+70%乙醇+）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 脫鈣 本組研究中采用福爾馬林作為固定劑，首先鋸取厚度約0.5 cm骨片，經(jīng)10%甲醛固定液固定24 h后，再經(jīng)10%甲醛固定液固定2 d；將骨塊置于濃度為15%的乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣劑中［6］，浸泡4～6周；所有標(biāo)本經(jīng)脫鈣處理后，均應(yīng)通過針刺法對于脫鈣效果進(jìn)行評估，如果標(biāo)本很容易被刺透且陰力較小，則說明脫鈣完全成功；如果仍然感覺陰力過大則應(yīng)重新進(jìn)行脫鈣處理，方法與上述方法一致。

1.2.5 HE染色 切片脫蠟處理采用二甲苯，脫蠟后用酒精將切片上的二甲苯徹底消除，用電吹風(fēng)吹干，增加切片附貼的牢固性，保證了染色的成功率；切片在放入蘇木糖染液前應(yīng)用電吹風(fēng)吹干水分，避免蘇木精染液濃度與pH值發(fā)生變化，達(dá)到延長使用壽命的目的［7］。脫蠟處理后，要避免切片干涸影響切片的無水效果?？稍谇衅狭粲猩倭慷妆?，使其與潮濕空氣隔絕，保證切片無水，同時滴上中性樹膠，保證保存效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。成熟度測量使用描述分析［8］。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨痂厚度

經(jīng)HE染色觀察，造模后3 d，三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后7 d，B組明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后14 d，A組與B組明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后21 d，B組明顯高于A組與C組，且A組明顯高于C組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 骨痂成熟度

A組與B組大鼠術(shù)后3 d即可見到骨內(nèi)外膜開始增厚，術(shù)后7 d有新生血管出現(xiàn)，骨折端肉芽組織形成，骨折間隙出現(xiàn)大量纖維母細(xì)胞并有少量的成骨細(xì)胞；術(shù)后14 d骨折端肉芽組織、新生毛細(xì)血管與纖維性骨痂開始重新生長，骨生成細(xì)胞大量出現(xiàn)；術(shù)后21 d骨折端纖維性骨痂與纖維母細(xì)胞有明顯減少，纖維性骨痂逐漸被軟骨骨痂和編織骨痂所取代；C組術(shù)后3、7 d骨內(nèi)、外膜也有所增厚，但是與術(shù)前相比差異不明顯，骨原細(xì)胞逐漸增生形成骨樣組織與軟骨，術(shù)后14、21 d骨痂中纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管密度及纖維性結(jié)締組織有明顯增加，出現(xiàn)新生血管，但是成骨細(xì)胞的增殖數(shù)量與A、B組相比明顯偏低，而且骨痂的成熟度也相對較低，內(nèi)外骨痂改造塑形期出現(xiàn)較晚。

3 討論

臨床中一般將骨折的愈合過程分為三個階段［9］：第一階段是炎癥階段，即創(chuàng)作局部組織的自我調(diào)整，此時局部壞死的組織會被清除或吸收；骨折早期由于周圍血腫被逐步清除，骨折局部充質(zhì)細(xì)胞大量增殖，同時釋放轉(zhuǎn)化生長因子、骨形成蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等，加快間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞的速度。第二階段是修復(fù)階段，主要是指新生組織（即膜內(nèi)化骨與軟骨內(nèi)化骨）修復(fù)［10］；軟骨細(xì)胞在鈣化過程中會分泌Ⅰ型膠原生平骨基質(zhì)蛋白，誘發(fā)骨基質(zhì)礦化，從而形成編織骨。編織骨會沿著應(yīng)力方向進(jìn)行規(guī)律的、斜形螺旋狀排列。第三階段是塑形階段，經(jīng)過前兩個階段的恢復(fù)，創(chuàng)作局部的骨折端與周圍組織已經(jīng)進(jìn)入正常生長發(fā)育期，為進(jìn)一步愈合提供條件，編織骨會逐漸轉(zhuǎn)化為板層骨，基本恢復(fù)了骨的原有結(jié)構(gòu)和功能，相鄰的骨板膠原纖維走向會呈現(xiàn)互相交叉的三維狀態(tài)，以增強(qiáng)其在各個方向上的抗張強(qiáng)度。骨折愈合的過程是一個持續(xù)、漸進(jìn)的過程，同時也是暫時性緊急連接到永久性堅(jiān)固連接的過程。

骨痂的構(gòu)建與重塑是整個骨折愈合過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)［11］，但骨痂成熟程度只與骨痂質(zhì)量有直接關(guān)系，而與骨痂的體積與范圍無明顯關(guān)聯(lián)。正常骨痂的X線表現(xiàn)為骨痂致密，成骨細(xì)胞排列緊密，有少量游離的破骨細(xì)胞，骨小梁有規(guī)律地沿應(yīng)力線排列，新生營養(yǎng)血管已經(jīng)形成，骨陷窩內(nèi)可見皮質(zhì)骨。本組研究中，造模后3 d，A、B、C組的骨痂厚度間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后7 d，B組的骨痂厚度明顯高于A組與兩組C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；造模后14 d，A組與B組的骨痂厚度明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后21 d，B組的骨痂厚度明顯高于A組與C組，且A組明顯高于C組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。說明茶多酚會在一定程度上促進(jìn)骨痂厚度的增加，而且這種促進(jìn)作用與茶多酚的使用劑量呈明顯的正相關(guān)。

軟骨細(xì)胞損傷的主要臨床表現(xiàn)以核固縮、線粒體腫脹、嵴斷裂或空泡變性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒等為主［12］，Ⅱ型膠原損傷主要表現(xiàn)為纖維纖細(xì)或腫脹、粗大，部分區(qū)域纖維融解，結(jié)構(gòu)消失。通過本組研究，可以發(fā)現(xiàn)A組與B組大鼠術(shù)后3 d即可見到骨內(nèi)外膜開始增厚，術(shù)后7 d骨折端肉芽組織形成，術(shù)后14 d骨折端肉芽組織開始重新生長，術(shù)后21 d骨折端纖維性骨痂與纖維母細(xì)胞有明顯減少；C組術(shù)后3 d及術(shù)后7 d骨內(nèi)、外膜也有所增厚，但是與術(shù)前相比差異不明顯，術(shù)后14、21 d骨痂中纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管密度及纖維性結(jié)締組織有明顯增加，出現(xiàn)新生血管，但是成骨細(xì)胞的增殖數(shù)量與A、B組相比明顯偏低，而且骨痂的成熟度也相對較低，內(nèi)外骨痂改造塑形期出現(xiàn)較晚。A組與B組的擴(kuò)張粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔內(nèi)可見一定量的蛋白粒子；A組與B組超微病理病變程度有所減輕，提示茶多酚對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和Ⅱ型膠原的損傷具有一定的保護(hù)作用。

活性氧主要包括超氧離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH-），廣泛存在于人體細(xì)胞內(nèi)，其作用是維持人體細(xì)胞信號的正常傳導(dǎo)，當(dāng)抗氧化物酶體系受損時，抗氧化系統(tǒng)及氧化系統(tǒng)會出現(xiàn)功能失衡，從而增加活性氧含量，使線粒體內(nèi)活性氧大量堆積。有報(bào)道稱，骨關(guān)節(jié)病及骨折患者或模型動物的血清和關(guān)節(jié)液中的氧自由基水平會異常升高，降低谷朧甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶及氧自由基清除劑的活性［13］，同時增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量。

茶多酚是茶葉提純物中的30多種酚類化合物復(fù)合體的總稱，不是一種單一的物質(zhì)。茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化作用，而且可以通過多種途徑發(fā)揮其抗氧化作用，并在一定程度上減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，減輕機(jī)體的氧化損傷，茶多酚還能與機(jī)體內(nèi)存在的抗氧化防御體系協(xié)同作用，更好地發(fā)揮防御系統(tǒng)的作用，維持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡［14］。另外，最新的研究結(jié)果證實(shí)，茶多酚還具有防止衰老及抗腫瘤和抗輻射的作用，同時在降低血糖、血脂方面也有非常理想的作用，具有明顯的抑菌、抑酶等藥理功能。有試驗(yàn)證實(shí)，茶多酚的抗氧化功效是維生素E的18倍，是維生素C的100倍［15］，通過多個動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯勘砻?，茶多酚可以有效地抑制氧化損傷造成的DNA堿基的損傷，并能很好地抑制8-OHdG的累積，其中，8-OHdG為氧化損傷的重要標(biāo)志物。更重要的是由于茶多酚是天然化合物，臨床使用劑量較小，因此在臨床治療中不存在毒副作用，安全性高。

總之，茶多酚對骨關(guān)節(jié)軟骨氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，其可以通過促進(jìn)骨痂增殖分化，增加骨痂含量，加快骨痂的成熟，從而提高骨折的愈合速度。

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The protective role of tea polyphenols on oxidative injury of rat articular cartilage

YAN Bin1YU Fei2WANG Lisheng2HAN Shiying3
1.Department of Orthopedics,the People＇s Hospital in Pingshan New District,Guangdong Province,Shenzhen 518000, China;2.Department of Orthopedics,Xixiang People＇s Hospital Affiliated to Guangdong Medical College,Guangdong Province,Shenzhen 518000,China;3.Department of Orthopedics,the First Hospital Affiliated to Zhongshan University, Guangdong Province,Guangzhou 510080,China

ObjectiveTo explore the protection of tea polyphenols on oxidative injury of the rat articular cartilages to further understand the effect of intake of tea polyphenols on the early healing of the fracture.Methods 45 healthy male Sprague-Dawley rats which were 3-4 month old were selected as the research objects and randomly divided into A,B, C three groups,15 rats in each group.The rats in each group manufactured biological effects of tea polyphenols before fracture and the rats in the three groups received subcutaneous injection.The rats in group A were injected 5 mg/(kg·d) of tea polyphenols,rats in group B were injected 10 mg/(kg·d)of tea polyphenols,while rats in group C were injected 0.5 mL/(kg·d)physiological brine.Three weeks after the injection,the fracture model of each rat middle radius 1/3 junction caused by left radius 3 mm complete bone defectis were not fixed;after fracture continue to inject tea polyphenols,tea polyphenols manufacturing fracture afterbiological effects were observed by HE staining;rats in different period of fracture healing (model after 3,7,14,21 d)of bone thickness and bone callus maturity.Results①Callus thickness:observed by HE staining,3 d after modeling,significant comparison between three groups showed that,differences were not statistically significant(P＞0.05);7 d after modeling,group B was significantly higher than the other two groups,differences had statistical significance (P＜0.05);14 d after modeling,group A and group B wassignificantly higher than that in group C,differences were statistical significance(P＜0.05);21 d after modeling,group B was significantly higher than that in group A and group C,and group A was significantly higher than that in group C, differences were statistical significance (P＜0.05).②3 d after the operation in group A and group B rats can be seen in the outer membrane of bonethickens,7 d after operation fracture end of granulation tissue formation,14 d after operation fracture end of granulation tissue growing back,after 21 d fracture of fibrous callus and fibroblast were significantly reduced in group C;3,7 d after operation,bone in outer membrane had thickened,but the difference was not significant compared with the preoperative,postoperativefiber 14,21 d in callus cells,capillary density and fibrous connective tissue increased significantly,neovascularization,but the osteoblast proliferationcompared with group A,group B was significantly lower,and the callus maturity is relatively low,internal,external callus transformation and shaping period appeared later.Conclusion Tea polyphenols has a significant protective effect on articular cartilage of oxidative damage,which canpromote the proliferation and differentiation of the callus,callus content increase,accelerate callus of mature,so improve the fracture healing rate.

Tea polyphenols;Articular cartilage;Oxidative damage;Protection;Tumor necrosis factor

R285

A

1673-7210(2015)01(b)-0016-04

2014-10-17本文編輯：衛(wèi) 軻）

廣東省深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃社會公益項(xiàng)目（編號440430140655）。