對(duì)水質(zhì)檢測(cè)中菌落計(jì)數(shù)結(jié)果質(zhì)量控制的探討

（山東省濰坊市市政公用事業(yè)管理處，261041，濰坊）

一、材料與方法

1.樣品來源

美國(guó)IDEXX菌落總數(shù)質(zhì)控樣品、濰坊市中心城區(qū)管網(wǎng)末梢水及濰坊市峽山水庫地表水。

2.檢測(cè)方法

依據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2006）中的平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，培養(yǎng)基采用北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)為20140102，并在有效期內(nèi)使用。

二、結(jié)果與分析

在水質(zhì)菌落總數(shù)檢測(cè)過程中，對(duì)檢測(cè)結(jié)果引起誤差的因素主要有培養(yǎng)基、重復(fù)性、檢測(cè)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、傾注平板時(shí)培養(yǎng)基溫度、同一稀釋度平行平板讀數(shù)、不同稀釋度平行平板讀數(shù)、不同實(shí)驗(yàn)人員對(duì)同一水樣菌落總數(shù)的讀數(shù)等。結(jié)合山東省濰坊市水質(zhì)的特點(diǎn)，主要討論培養(yǎng)基、檢測(cè)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、平行平板重復(fù)性、不同人員對(duì)同一平板讀數(shù)等5個(gè)因素。

1.培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響及控制措施

培養(yǎng)基是微生物賴以生存的生命之本，培養(yǎng)基制備直接影響著微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響了檢測(cè)結(jié)果。因此，應(yīng)嚴(yán)格按照培養(yǎng)基的配方及說明認(rèn)真制備培養(yǎng)基，每批培養(yǎng)基在使用前都要進(jìn)行符合性驗(yàn)證，主要包括陽性對(duì)照及無菌試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用大腸埃希氏菌（ATCC25922）進(jìn)行劃線培養(yǎng)，計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)G，結(jié)果為G=13（G≥6時(shí)培養(yǎng)基可以接受），并且經(jīng)空白測(cè)定證明無菌。因此，本批次培養(yǎng)基可以進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定。

2.檢測(cè)時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)結(jié)果的影響

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定微生物水樣保存時(shí)間為4 h，但是在實(shí)際工作中有時(shí)候因采樣地點(diǎn)路程較遠(yuǎn)等因素，不能在4 h內(nèi)完成檢測(cè)。將質(zhì)控菌片溶解后立即檢測(cè)，經(jīng)4℃冷藏存放2 h、4 h、6 h、8 h、23 h、24 h、30 h、48 h、72 h后分別檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，對(duì)質(zhì)控菌片用無菌生理鹽水溶解后立即檢測(cè)、間隔2 h到23 h后檢測(cè)，菌落總數(shù)結(jié)果變化不明顯，均在20 CFU/mL左右，符合真值20 CFU/mL；從24 h開始，數(shù)值呈現(xiàn)較大的變化趨勢(shì)，并逐漸超出質(zhì)控樣可接受范圍（2～38 CFU/mL）。由此可見，檢測(cè)時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)結(jié)果可靠性影響較大，由于細(xì)菌的繁殖隨時(shí)間呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，在室溫條件下存放水樣更會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的繁殖，因此微生物水樣必須在4℃冷藏，取來后應(yīng)立即檢測(cè)，最長(zhǎng)不宜超過24 h。

圖1 檢測(cè)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

3.培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)結(jié)果的影響

分別對(duì)菌落總數(shù)質(zhì)控樣品和含菌量較高的水樣品進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè)，不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)的影響呈現(xiàn)一定的變化趨勢(shì)，具體如圖2所示。

從圖2可以看出，細(xì)菌種類單一的質(zhì)控樣品培養(yǎng)在24 h～48 h～72 h之間，結(jié)果沒有發(fā)生較大的變化，在平板計(jì)數(shù)時(shí)只是菌落大小隨時(shí)間增長(zhǎng)有所增大，數(shù)量變化不大。然而，含菌量較高的水樣品，細(xì)菌種類較復(fù)雜，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，變化趨勢(shì)比較明顯。培養(yǎng)24 h時(shí)菌落總數(shù)小于200 CFU/mL，在24 h～46 h間結(jié)果逐漸上升，在46 h～50 h間菌落總數(shù)基本沒有發(fā)生變化，從70 h開始菌落總數(shù)明顯增高。因此，在日常水樣檢測(cè)中，培養(yǎng)時(shí)間是影響結(jié)果準(zhǔn)確的主要因素之一，應(yīng)規(guī)范操作，將培養(yǎng)時(shí)間控制在48±2 h為宜。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響

4.不同檢測(cè)人員對(duì)同一菌落讀數(shù)結(jié)果的影響

采用7位檢測(cè)員對(duì)同一平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算平均值、誤差率以及可接受區(qū)間，具體結(jié)果見表1。

表1 7位實(shí)驗(yàn)人員對(duì)同一平板計(jì)數(shù)的結(jié)果

從表1中可以看出，7位實(shí)驗(yàn)人員的計(jì)數(shù)結(jié)果均在可接受范圍之內(nèi)，與均值誤差率小于5%，最大值與最小值誤差為8.86%，滿足不同人員對(duì)同一平板計(jì)數(shù)誤差小于18.2%的北歐標(biāo)準(zhǔn)。因此，就本實(shí)驗(yàn)室而言，不同人員對(duì)同一平板讀數(shù)引起的誤差較小，在實(shí)際工作中可以作為次要因素考慮。

5.樣品重復(fù)性測(cè)定

在微生物檢驗(yàn)中，樣品中細(xì)菌分布的均勻性和重復(fù)測(cè)定帶來的誤差是影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素之一。根據(jù)濰坊地區(qū)水質(zhì)的特點(diǎn)，對(duì)三種細(xì)菌密度的水樣進(jìn)行測(cè)定。

（1）質(zhì)控樣品的重復(fù)性測(cè)定

采用美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)的HPC/TVC（E.faecalis）質(zhì)控樣品，真值20 CFU/mL，可接受范圍2～38 CFU/mL，重復(fù)檢測(cè)20次，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

平板間誤差規(guī)定要求≤10%，但在實(shí)際工作中有時(shí)不易達(dá)到。從表2中可以看出，最大值與最小值的誤差為28.57%，大于10%，但20次檢測(cè)結(jié)果均接近于真值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.72%。周紅雨曾在《泊松分布應(yīng)用于菌落總數(shù)質(zhì)量控制》一文中闡明，當(dāng)時(shí)，平行平板a1、a2之間的計(jì)數(shù)結(jié)果較理想。從表2中可知，20組數(shù)據(jù)符合泊松分布，最大值為24 CFU/mL，最小值為18CFU/mL，符合上述公式。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，當(dāng)菌落總數(shù)測(cè)定值為10～30 CFU/mL時(shí)，可以用判定平行平板檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 質(zhì)控樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果

表3 菌落總數(shù)較低時(shí)，水樣品菌落總數(shù)重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

表4 菌落總數(shù)較高水樣品菌落總數(shù)重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

（2）水樣品重復(fù)性測(cè)定

在日常水質(zhì)監(jiān)督檢測(cè)時(shí)，由于各縣市區(qū)水質(zhì)特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝等有所差別，因此出廠水及管網(wǎng)水的菌落總數(shù)結(jié)果各有不同。通過對(duì)2010—2014年濰坊地區(qū)生活飲用水衛(wèi)生狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)水廠消毒較好，菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果在30 CFU/mL以下，甚至有些水廠的出廠水、管網(wǎng)水菌落總數(shù)未檢出，只有個(gè)別水廠水樣結(jié)果偏高甚至出現(xiàn)超標(biāo)情況。結(jié)合工作實(shí)際，對(duì)這兩種情況的重復(fù)性分別分析，初步確定平行平板間的判定標(biāo)準(zhǔn)，為以后的工作提供參考。

①菌落計(jì)數(shù)結(jié)果小于10CFU/mL時(shí)的重復(fù)性

在生活飲用水菌落總數(shù)測(cè)定時(shí)，菌落總數(shù)結(jié)果較低，此時(shí)重復(fù)性測(cè)定如表3所示。

根據(jù)北歐標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，自身同一梯度平行加樣兩皿間的相對(duì)誤差小于7.7%。但是，實(shí)際工作有時(shí)很難達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，特別是在菌落總數(shù)較低時(shí)，如表3中的數(shù)據(jù)顯示，菌落總數(shù)均小于10 CFU/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差達(dá)到38.25%。然而通過計(jì)算可知，表3中數(shù)據(jù)符合，并且Grubbs檢驗(yàn)后均無異常值。因此，菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果小于10 CFU/mL時(shí)，可以用判定平行平板檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

②菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為30～300CFU/mL時(shí)的重復(fù)性

將峽山水庫水樣稀釋10倍，重復(fù)測(cè)定20次，以此反映菌落總數(shù)結(jié)果較高時(shí)的重復(fù)性，僅供參考。結(jié)果如表4所示。

從表4中可以看出，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果在30～300 CFU/mL時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%，符合北歐標(biāo)準(zhǔn)。而且通過計(jì)算可知，表4數(shù)據(jù)符合，經(jīng)Grubbs檢驗(yàn)后均無異常值。可見，菌落總數(shù)較高時(shí)精密度較高，結(jié)果更準(zhǔn)確。當(dāng)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果在30～300 CFU/mL之間時(shí)，可以用a1+判定平行平板檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

三、結(jié) 論

①在生活飲用水菌落總數(shù)質(zhì)控過程中，除了設(shè)施環(huán)境、培養(yǎng)基、培養(yǎng)箱溫度等硬件需滿足要求外，樣品重復(fù)性、檢測(cè)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間、檢測(cè)人員讀數(shù)等也是影響結(jié)果的主要因素，不同人員對(duì)同一平板讀數(shù)引起的誤差較小，在實(shí)際工作中可以作為次要因素考慮。

②檢測(cè)時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間是質(zhì)量控制的主要因素之一，應(yīng)嚴(yán)格規(guī)范操作。微生物水樣的運(yùn)輸及保存均應(yīng)冷藏，樣品取來后應(yīng)立即檢測(cè)，最長(zhǎng)不宜超過24 h。

③培養(yǎng)時(shí)間因樣品細(xì)菌種類的純度對(duì)結(jié)果的影響有所不同。對(duì)于細(xì)菌種類單一的質(zhì)控樣品，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，其結(jié)果沒有明顯的變化；而對(duì)于種類復(fù)雜的水樣品，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其結(jié)果的影響較大，培養(yǎng)時(shí)間最好控制在48±2 h。

④菌落總數(shù)的高低可能會(huì)導(dǎo)致重復(fù)性的不同。計(jì)數(shù)結(jié)果在30～300 CFU/mL之間時(shí)，精密度為4.4%，重復(fù)性好；計(jì)數(shù)結(jié)果較低（小于10 CFU/mL）時(shí)，精密度為38.25%，重復(fù)性較差；計(jì)數(shù)結(jié)果在10～30 CFU/mL之間時(shí)，精密度為9.72%，重復(fù)性較好。

[1]北歐食品分析委員會(huì).微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證準(zhǔn)則[S].1994.

[2]張宗寶.誤差率結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行質(zhì)控的應(yīng)用體會(huì)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)，1995，5（5）.

[3]周紅雨.泊松分布應(yīng)用于菌落總數(shù)的質(zhì)量控制[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)，2000，10（6）.

[4]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法（GB/T 5750—2006）[S].2007.

[5]中華人民共和國(guó)建設(shè)部.城市供水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（CJ/T 206—2005）[S].2005.