基于分光光度法測定血液中非那西丁與撲熱息痛含量的肝臟儲備功能評估

逯素梅，任瑞，孫濤，馬永梅，馬萬山(山東省千佛山醫(yī)院，濟南 250014)

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基于分光光度法測定血液中非那西丁與撲熱息痛含量的肝臟儲備功能評估

逯素梅，任瑞，孫濤，馬永梅，馬萬山(山東省千佛山醫(yī)院，濟南 250014)

摘要：目的建立基于分光光度法測定非那西丁與撲熱息痛含量的肝臟儲備功能評估方法。方法篩選分光光度測定的顯色體系，確定最大吸收波長，分析不同因素對顯色體系的影響，優(yōu)化非那西丁與撲熱息痛水解的最佳條件，最后對技術(shù)體系進行應(yīng)用性驗證。結(jié)果建立了利用分光光度測定樣品中非那西丁和撲熱息痛含量的技術(shù)體系，即樣品加入3 mol/L鹽酸水解30 min，加入0.02% 1,2-萘醌-4-磺酸鈉、1%十六烷基三甲基溴化銨及2% NaOH(或3% Na2CO3)(比例為1∶6∶1∶2或3)，分別于500 nm和570 nm下測定吸光值，計算各自濃度。該技術(shù)測定血漿樣品中非那西丁與撲熱息痛時的分辨率和重復(fù)性與高效液相色譜法相當(dāng)。結(jié)論利用分光光度技術(shù)測定血液中非那西丁與撲熱息痛含量，二者比值具有評估肝臟儲備功能價值。

關(guān)鍵詞：肝臟儲備功能；分光光度技術(shù)；非那西??；撲熱息痛

肝臟儲備功能是肝臟所有儲備肝細(xì)胞功能的總和，其在決定是否進行肝切除術(shù)及方案選擇上起著不可替代的地位[1]，但目前臨床使用的肝臟儲備功能評價技術(shù)和指標(biāo)存在諸多不足。如常用的肝功能生化指標(biāo)ALT、AST、GGT和LDH，只是表征肝細(xì)胞受損，并非肝臟儲備功能的指標(biāo)[2,3]；凝血酶原時間、血漿白蛋白和血漿膽紅素含量能夠反映肝臟的功能，但卻受腎臟排泄功能、胃腸道的消化吸收功能和血紅蛋白的分解代謝等因素影響，造成檢測靈敏度低，特異性差，難以滿足臨床的需要。因此，建立靈敏度高、特異性強的肝臟儲備功能評價體系是當(dāng)前臨床迫切需要解決的重要課題。其中，利用探針?biāo)幬餃y定肝臟藥物代謝酶細(xì)胞色素P450的活性評價肝臟儲備功能備受重視[4]。

細(xì)胞色素P450-1A2 (CYP1A2)是CYP酶系的重要家族之一，占整個細(xì)胞色素酶P450的15%[5]，在人的肝臟呈組成型表達，參與內(nèi)源性(膽汁酸、膽固醇等)及外源性物質(zhì)(藥物、毒物)的生物轉(zhuǎn)化[6,7]，是臨床評價肝臟儲備功能的理想靶點。CYP1A2的外源性底物包括咖啡因、非那西丁、茶堿等[8]。研究表明，非那西丁是CYP1A2酶活性的特異性底物[9～11]，在肝臟代謝的第一步包括O-脫乙基、N-脫乙?；?-羥化反應(yīng)等過程，其中O-脫乙基化生成撲熱息痛是非那西丁生物轉(zhuǎn)化的主要步驟。Cui等[12]研究表明，非那西丁O-脫乙基酶在肝臟外組織中的活性極低，非那西丁O-脫乙基反應(yīng)只有不到5%是在肝臟外進行的，因此非那西丁O-脫乙基作用可作為評價肝臟CYP1A2活性的專屬性和指示性反應(yīng)。服用探針?biāo)幬锓悄俏鞫『?，測定一定時間內(nèi)血液中非那西丁與撲熱息痛的比值，用以反映CYP1A2活性及藥物之間的相互作用[13，14]，即能準(zhǔn)確反映肝臟的生物轉(zhuǎn)化功能。

1材料與方法

1.1材料人外周血標(biāo)本采自2012年1月～2014年1月健康成年人新鮮的外周血。試劑包括非那西丁(Sigma公司)，撲熱息痛(Sigma公司)，對氨基苯酚(阿法埃莎公司)，對氨基苯乙醚(阿法埃莎公司)，1,2-萘醌-4-磺酸鈉(NQS，日本化成工業(yè)株式會社)，十六烷基三甲基溴化銨(CTA，國藥集團化學(xué)試劑公司)，茶堿(國藥集團化學(xué)試劑公司)，硫化鈉(國藥集團化學(xué)試劑公司)，高錳酸鉀(國藥集團化學(xué)試劑公司)，重鉻酸鉀(國藥集團化學(xué)試劑公司)，甲醇(Merk公司)，鹽酸(國產(chǎn))，Na2CO3(國產(chǎn))，NaOH(國藥集團化學(xué)試劑公司)。儀器包括Cary100型紫外-可見分光光度計(美國Varian公司)，Alliance 2695型高效液相色譜儀(2998UV檢測器)(美國Waters公司)，Pico型微量臺式離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Stratos高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)，TW12型恒溫水浴槽(德國JULABO公司)，XBRIDGE C18色譜柱(美國Waters公司)。

1.2方法

1.2.1顯色體系的選擇

1.2.1.1顯色劑的篩選經(jīng)查閱文獻和實驗研究表明，非那西丁和撲熱息痛不易與其他化合物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，而二者的水解脫乙?；a(chǎn)物對氨基苯乙醚和對氨基苯酚可與多種物質(zhì)生成有色產(chǎn)物，從而為分光光度法測定非那西丁和撲熱息痛奠定了基礎(chǔ)。在人體內(nèi)，非那西丁和代謝產(chǎn)物撲熱息痛是混合在一起的，且含量較低。因此，顯色體系應(yīng)滿足以下條件：①顯色劑在常溫下應(yīng)穩(wěn)定，常溫下能迅速與非那西丁和撲熱息痛反應(yīng)，有色產(chǎn)物穩(wěn)定。②顯色劑若為一組，則與非那西丁和撲熱息痛反應(yīng)可產(chǎn)生顏色不同的產(chǎn)物，且二者最大吸收波長差值應(yīng)盡量大，該種情況下選擇雙波長分光光度技術(shù)測定非那西丁和撲熱息痛的含量；顯色劑可為兩組，即測定非那西丁和撲熱息痛的顯色劑不同，這種情況下要求顯色劑應(yīng)具有專屬性即測定非那西丁(或撲熱息痛)的顯色劑與撲熱息痛(或非那西丁)不反應(yīng)或不生成能造成干擾的有色產(chǎn)物。③顯色劑不易受其他常規(guī)藥物或血清的干擾。④非那西丁和撲熱息痛水解后與顯色劑直接反應(yīng)或二次處理簡單。

1.2.1.2最大吸收波長配制一定濃度的對氨基苯乙醚和對氨基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入顯色劑，待反應(yīng)穩(wěn)定后用紫外分光光度計在800～200 nm的范圍內(nèi)進行掃描，記錄掃描結(jié)果，以確定最大吸收波長。

1.2.1.3干擾因素分析配制一定濃度的對氨基苯乙醚和對氨基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入干擾因子(如測定對氨基苯乙醚加入對氨基苯酚、血清等)，加入顯色劑，待反應(yīng)穩(wěn)定后用紫外分光光度計在800～200 nm的范圍內(nèi)進行掃描，記錄掃描結(jié)果，分析各干擾因素的影響。

1.2.2顯色體系的優(yōu)化根據(jù)目標(biāo)顯色體系，分別從以下幾方面對顯色體系進行優(yōu)化：①顯色劑各組分添加次序的選擇；②顯色劑用量的優(yōu)化；③pH值優(yōu)化；④顯色時間優(yōu)化；⑤顯色溫度優(yōu)化。

1.2.3非那西丁與撲熱息痛水解條件的建立使非那西丁與撲熱息痛水解脫乙酰基完全可采取兩種策略即堿水解和酸水解，由于NaOH水解兩種藥物時條件不易控制且不安全，因此本研究采取酸(鹽酸)水解，并對酸的濃度、水解時間進行了探索和優(yōu)化。

2結(jié)果

2.1顯色體系的選擇根據(jù)文獻和反復(fù)實驗研究表明，能單獨與非那西丁和撲熱息痛的脫乙酰產(chǎn)物對氨基苯乙醚和對氨基苯酚反應(yīng)生成有色產(chǎn)物的顯色劑很多，但經(jīng)過預(yù)實驗初步確定兩組顯色體系可用于測定同時存在于血液樣品中的兩種物質(zhì)。其中一種顯色體系為氨基苯乙醚和對氨基苯酚與NQS反應(yīng)生成黃紅色或紫紅色產(chǎn)物，二者顏色有差別但差別不大，如果加入CTA，則起到增色作用。對氨基苯酚和對氨基苯乙醚與NQS反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長分別為530 nm和465 nm，加入CTA后，最大吸收波長向長波向方向移動，分別變?yōu)?70 nm和500 nm。因此選擇NQS+CTA作為對氨基苯酚和對氨基苯乙醚的顯色體系。

2.2顯色體系的優(yōu)化

2.2.1顯色劑濃度和添加次序的優(yōu)化1 mL待測溶液(含25～500 μg樣品)，加入0.02% NQS 4～8 mL，1% CTA 0.5 mL均能得到理想的顏色反應(yīng)結(jié)果，因此選擇6 mL NQS和1 mL CTA，二者加入次序?qū)y定結(jié)果無影響。

2.2.2酸堿度及溫度對顯色的影響反應(yīng)體系的酸堿對測定影響很大[15,16]，測定對氨基苯酚(撲熱息痛)時，加入1～4 mL 2% NaOH紫紅色產(chǎn)物穩(wěn)定，能得到理想結(jié)果；測定對氨基苯乙醚(非那西丁)時，有色產(chǎn)物NaOH中不穩(wěn)定，加入1～6 mL 2% Na2CO3產(chǎn)物穩(wěn)定，若低于3 mL則不穩(wěn)定。因此，選擇2 mL 2% NaOH和3 mL 2% Na2CO3用于撲熱息痛和非那西丁的測定。有色產(chǎn)物在5～80 ℃溫度范圍內(nèi)均較穩(wěn)定，超過80 ℃，吸光值迅速下降。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立配制系列不同濃度的對氨基苯乙醚和對氨基苯酚，分別依次加入6 mL NQS、1 mL CTA、2 mL 2% NaOH(對氨基苯酚)或3 mL 2% Na2CO3(對氨基苯乙醚)，定容至25 mL，于分光光度測定。繪A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1。回歸方程分別為：A570=0.071 6×(PRL濃度)+0.003 1，A500=0.025 1×(PHN濃度)+0.010 5。

圖1　非那西丁與撲熱息痛A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3非那西丁與撲熱息痛最佳水解條件建立上述方面建立的分光光度法所測定的實際是非那西丁與撲熱息痛的水解脫乙酰基的產(chǎn)物，因此確保樣品中的非那西丁與撲熱息痛完全水解是極關(guān)鍵的一步。本項目采取鹽酸水解。首先確定最佳鹽酸濃度，其中水解率=1-測試含量/初始含量，含量均利用建立的HPLC技術(shù)測定。非那西丁與撲熱息痛鹽酸水解的最佳濃度均為2～6 mol/L。配濃度均為3 mmol/L的非那西丁和撲熱息痛混合溶液，采用3 mol/L的鹽酸水解，以確定最佳水解時間，其中水解率=1-測試含量/初始含量，含量均利用前面建立的HPLC技術(shù)測定。得出非那西丁與撲熱息痛最佳水解時間均為30 min。

2.4應(yīng)用驗證取健康人血漿，配制不同濃度的非那西丁和撲熱息痛混合溶液，每種濃度溶液分為兩份，一份利用HPLC技術(shù)測定含量，另一份利用建立的水解條件水解、加入顯色劑、測定吸光值并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。在濃度為1～20 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，利用所建立的分光光度技術(shù)進行測定，RSD均<10%，當(dāng)濃度超過5 μg/mL時，RSD<5%，測定更加準(zhǔn)確，重復(fù)性好。見表1。

表1　HPLC與分光光度技術(shù)測定比較(n=4)

3討論

在評價肝臟儲備功能方面，有許多不同的方法?？偟膩碚f，傳統(tǒng)生化指標(biāo)較易測定，臨床上廣泛應(yīng)用；定量肝功能試驗及影像學(xué)手段，操作較復(fù)雜，試劑設(shè)備要求較高；臨床肝功能分級綜合幾個生化指標(biāo)，準(zhǔn)確性較高，但有一定局限，尤其是在反映肝臟在承受外來額外負(fù)荷時。因此，正確評價肝臟儲備功能，是目前臨床迫切需要解決的重要課題。

探針?biāo)幬镌囼炇峭ㄟ^測定代謝產(chǎn)物含量的變化，評價肝臟的功能狀態(tài)，但代謝產(chǎn)物的形成過程，不僅與肝臟本身功能相關(guān)，還受生物利用度、蛋白結(jié)合率、腎功能等的影響。CYP1A2在肝內(nèi)特異表達，約占肝臟CYP酶總量的13%[17]，是各種因素導(dǎo)致肝臟疾病的共同易損靶點[18]，約55%文獻選用非那西丁O-脫乙基化反應(yīng)研究體外CYP1A2活性[19]，其特異底物非那西丁在肝臟經(jīng)O-脫乙基化生成撲熱息痛，通過測定血液中非那西丁及撲熱息痛含量評估肝臟儲備功能，具有很大優(yōu)勢，主要包括找到了共同的易損靶點；肝外代謝極少；檢測終產(chǎn)物體現(xiàn)了生物轉(zhuǎn)化的連續(xù)性；受胃腸吸收、腎臟排泄功能的影響小。此外，非那西丁具有對人體影響小，簡便測定等優(yōu)點[20]，且價格低廉，因此，其是臨床實驗的一個理想探針?biāo)幬铩?/p>

血液中的非那西丁和撲熱息痛含量均為微克級，需借助HPLC、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)才能準(zhǔn)確測定，這些經(jīng)典技術(shù)技術(shù)具有分辨率高、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，但分析儀器價格昂貴、測定成本高、步驟繁鎖，顯然無法滿足臨床肝臟功能大規(guī)模檢測的要求。考慮到臨床檢驗的儀器如全自動生化分析儀、酶標(biāo)儀、分光光度計均基于分光光度技術(shù)，建立基于分光光度技術(shù)的非那西丁與撲熱息痛的高分辨測定技術(shù)，從而為研究開發(fā)實用性強的新型肝臟儲備功能檢測試劑盒奠定堅實的基礎(chǔ)。

本研究建立了利用分光光度技術(shù)測定血液樣品中微量非那西丁和撲熱息痛的技術(shù)體系，即樣品加入3 mol/L鹽酸水解30 min，加入0.02% NQS、1% CTA及2% NaOH(或3% Na2CO3)(比例為1∶6∶1∶2或3)，分別于500 nm和570 nm下測定吸光值，計算各自濃度。本研究所建立的技術(shù)為開發(fā)基于血液中非那西丁和撲熱息痛比值的肝臟儲備功能檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。通過應(yīng)用性驗證，本研究所建立的分光光度技術(shù)具有分辨率高、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，而且克服了分析儀器價格昂貴、測定成本高、步驟繁鎖的不足，可以滿足臨床肝臟儲備功能大規(guī)模檢測的要求。

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Assessment of liver reserve function based on determination of phenacetin

and paracetamol by spectrophotometry

LUSu-mei,RENRui,SUNTao,MAYong-mei,MAWan-shan

(ShandongProvincialQianfoshanHospital,Jinan250014,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a liver reserve function assessment method based on detection of phenacetin and paracetamol by spectrophotometry. MethodsTo screen the spectrophotometric color system, determine the maximum absorption wavelength, analyze the influence of color system in different factors, optimize optimal conditions that phenacetin and paracetamol hydrolyze, and then verify the application of this technology about the established system. ResultsThe technology system detected phenacetin and paracetamol of blood samples using spectrophotometry was established, in which 3 mol/L hydrochloric acid was added to samples to hydrolyze for 30 min, then added 0.02% 1,2-naphthoquinone-4-sulfonate, 1% sixteen alkyl bromide and 2% sodium hydroxide (or 3% sodium carbonate) (ratio of 1∶6∶1∶2 or 3), and then the absorbance was measured under 500 nm and 570 nm to calculate each concentration. Resolution and repeatability of technology used for determining phenacetin and paracetamol of plasma samples were comparable with HPLC. ConclusionRatio of phenacetin and paracetamol under established spectrophotometric system could assess liver reserve function.

Key words:liver reserve function; spectrophotometry; phenacetin; paracetamol

(收稿日期：2014-11-04)

中圖分類號：R333.4

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)04-0014-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.04.005

通信作者簡介：馬萬山(1967-)，男，碩士，主任技師，研究方向為臨床醫(yī)學(xué)檢驗。E-mail: mwsqianyi@163.com

作者簡介：第一逯素梅(1982-)，女，博士，主管技師，研究方向為臨床醫(yī)學(xué)檢驗。E-mail: lsmqianyi@126.com

基金項目：山東省科技攻關(guān)項目(2009GG10002005)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(2007HW116)。