基于聚剛果紅薄膜修飾鉛筆芯電極的撲熱息痛電化學傳感器

暢凱麗，王笑楠，白 宇，洪 福，劉曉軍，鄭冬云

(中南民族大學生物醫(yī)學工程學院，武漢 430074； 中南民族大學腦認知國家民委重點實驗室，武漢 430074； 醫(yī)學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室，武漢 430074)

0 引言

撲熱息痛是國際醫(yī)藥市場上最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥[1]，副作用較小，又名對乙酰氨基酚，是乙酰苯胺藥物中最好的品種，但長期大劑量服用此藥會導致一些毒副作用[2]，因此精確檢測藥物中撲熱息痛含量對控制藥物質量、保證病人安全是非常必要的。

現有的撲熱息痛含量檢測方法包括分光光度法、高效液相色譜法、化學發(fā)光法、毛細管電泳法及電化學傳感法[3]等，其中電化學傳感方法因其靈敏度高、線性范圍寬、準確性高、響應快速及操作簡便等特點而被廣泛使用[4]。擬采用此方法，實現對撲熱息痛的快速準確檢測。

剛果紅(Congo Red，CR)是一種常用的酸堿指示劑，分子結構中含有電子給體氨基及多個共軛體系，使其不僅可起到媒介體作用，還具有較好的催化能力[5]。鉛筆芯成分主要為石墨與黏土，基于石墨的良好導電性，鉛筆芯可被用于制作鉛筆芯電極[6]。與傳統的玻碳電極、碳糊電極、熱解碳電極及碳纖維電極相比，鉛筆芯電極具有更好的化學惰性和機械性[7]。與金電極和鉑金電極相比，鉛筆芯電極具有較寬的適用電位窗口。此外，鉛筆芯電極還具有背景電流低、比表面積大、生物相容性良好、制備簡易、易于修飾和小型化特點[8]，可廣泛應用于電化學傳感領域。

采用電聚合法制備聚剛果紅薄膜，制備方法簡單可控。將鉛筆芯電極用作基底電極，操作簡單，成本低，便于批量生產。研發(fā)的基于聚剛果紅薄膜修飾鉛筆芯電極的撲熱息痛電化學傳感器，具有制備簡易、成本低、性能好等優(yōu)點，可快速準確檢測藥片中撲熱息痛的含量，具有良好的生物醫(yī)學應用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器有限公司生產)；PHS-3E 型酸度計(上海佑科儀器儀表有限公司子結構中的電子給體氨基及多個共軛體系)；FA2004A型電子分析天平；CL-200型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(金壇市予儀器有限責任公司子結構中的電子給體氨基及多個共軛體系)；日立場發(fā)射掃描電鏡(SU8010)；鉛筆芯(直徑為0.5 mm，2B，廠家：TOUCH LINE)及環(huán)氧樹脂膠(AB膠)均購于本地超市；導電銀膠購于深圳市鑫威新材料股份有限公司。

剛果紅購自中國遠航試劑廠；氯化鉀(KCl)購自天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司；對乙酰氨基酚、無水乙醇、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])及亞鐵氰化鉀(K4[Fe(CN)6])均購自國藥集團化學試劑有限公司。對乙酰氨基酚用無水乙醇配制成濃度為0.1 mol/L的標準溶液，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。以上試劑均為分析純，未經處理直接使用。實驗用水均為超純水。對乙酰氨基酚?泰諾，每片含主要成分撲熱息痛0.65 g)購自周邊藥店。

1.2 實驗方法

1.2.1 鉛筆芯裸電極的制備

基于參考文獻[9]制備裸鉛筆芯電極，簡單概括為：銅絲和一小段長2 cm的鉛筆芯用導電銀膠牢固粘接起來，自然晾干，而后緩慢將其穿入到塑料槍頭，用AB膠使槍頭兩端密封住。將鉛筆芯外露出的長度剪裁到5 mm，裸鉛筆芯電極(Pencil Graphite Electrode，PGE)制備完成。

使用前，將所制得的裸PGE置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]及1 mol/L KCl混合溶液中，在-0.2～+0.8 V電位范圍，進行速率為100 mV/s的循環(huán)伏安掃描，以檢查電極是否漏液，并保證所制得的裸PGE電極面積均幾乎相同，為傳感器具有良好的重現性提供了基礎保證。

1.2.2 聚剛果紅薄膜修飾鉛筆芯電極的制備

將檢驗合格的裸PGE放入0.1 mol/L的剛果紅水溶液中，在-0.2～+1.6 V的電位區(qū)間，循環(huán)伏安掃描15圈，掃描速率為100 mV/s，在其表面修飾聚剛果紅(poly(congo red)，PCR)薄膜，制得PCR/PGE，則為撲熱息痛電化學傳感器。

1.2.3 撲熱息痛在PCR/PGE上的電化學檢測

采用三電極系統作為檢測體系，其中，工作電極是裸PGE或PCR/PGE，鉑絲(Pt)為對電極，飽和甘汞電極(SCE)是參比電極。檢測底液為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液(PB，pH=4.0)，掃描電位區(qū)間0～1.2 V，富集電位0.2 V，富集時間50 s。

2 結果與討論

2.1 電極表面形貌特征

為探究撲熱息痛在PCR/PGE上的電催化機理，運用掃描電鏡(SEM)技術表征了不同電極的表面形貌，結果為圖1。裸PGE表面呈現典型的石墨片層狀結構，較平整(圖1A)，但是經過剛果紅薄膜修飾后，電極表面變得凹凸不平，呈溝壑狀，較疏松與粗糙(圖1B)。相比于裸PGE，PCR薄膜的修飾有效增大了電極的表面積，有助于撲熱息痛富集在電極表面，使撲熱息痛電化學傳感器的靈敏度得到提升。此外，作為電子媒介體，PCR還可以加快撲熱息痛與電極之間的電子傳遞速率，催化電極表面上撲熱息痛的氧化反應。

圖1 裸PGE (A) 和PCR/PGE (B) 的掃描電子顯微鏡(SEM)圖Fig.1 Scanning electron microscope(SEM) images of bare PGE (A) and PCR/PGE (B)

2.2 在不同電極上撲熱息痛的電化學響應

采用循環(huán)伏安法考察了1.0×10-5mol/L 撲熱息痛在裸PGE和PCR/PGE上的電化學響應，結果為圖2。撲熱息痛的電化學反應為準可逆的過程，在裸PGE上，幾乎觀察不到電化學響應(曲線a)。在PCR/PGE上，當底液中未添加撲熱息痛時，觀察不到電化學響應(曲線b)；但當底液中撲熱息痛為1.010-5mol/L時，可觀察到在0.569 V處氧化峰的峰形尖銳，峰電流為54.60 μA(曲線c)。顯然，PCR/PGE對撲熱息痛的電化學氧化具有良好的催化作用，可應用在撲熱息痛的電化學傳感。

圖2 裸PGE(a)和PCR/PGE(b, c)在含1.0×10-5 mol/L(a,c)和0 mol/L(b)撲熱息痛的0.1 mol/L PB溶液(pH=4.0)中的循環(huán)伏安圖(掃描速率：100 mV/s)Fig.2 Cyclic voltammograms of bare PGE(a) and PCR/PGE(b,c) in 0.1 mol/L PB buffer solution (pH=4.0) containing 1.0×10-5 mol/L (a,c) and 0 mol/L(b) paracetamol (scan rate:100 mV/s)

2.3 掃描速率對撲熱息痛電化學響應的影響

為確認撲熱息痛在PCR/PGE上電化學反應的機理，利用線性掃描伏安方法，研究了撲熱息痛伏安響應受掃描速率的影響程度，結果為圖3A。由圖3B可知，在25～375 mV/s的掃描速率區(qū)間內，隨著掃描速率的增加，撲熱息痛在PCR/PGE上的氧化峰電流呈增長趨勢，且和掃描速率的平方根具有較好的線性關系：Ip=35.95v1/2-0.96，R=0.994，這說明撲熱息痛在PCR/PGE上的電化學氧化反應是一個受擴散控制的過程。由圖3C可知，撲熱息痛在PCR/PGE上的氧化峰電位與掃描速率的自然對數呈良好的線性關系：Ep=0.022lnv+0.592，R=0.975，結合撲熱息痛在PCR/PGE上的電化學氧化是一個可逆的過程，對于受擴散控制且可逆的電化學反應，根據Heyrovsky-Ilkovic方程[10]，如下式所示，計算得撲熱息痛在PCR/PGE上電子轉移數為：n=1.972≈2，與已有報道[11]一致。

式中為E1/2半峰電位(V)，T為實驗溫度(K)，R為氣體常數(J/(mol*K))，n為轉移電子數，F為法拉第常數(C/mol)，IP為峰電流(A)。

2.4 底液pH值對撲熱息痛電化學響應的影響

檢測底液的pH值不僅會影響撲熱息痛在溶液中的荷電狀態(tài)，還會影響PCR/PGE表面的荷電狀態(tài)，進而影響撲熱息痛與PCR/PGE之間的相互作用，為保證傳感器的較高靈敏度，需要對檢測底液的pH值進行優(yōu)化。采用循環(huán)伏安法，對撲熱息痛在PCR/PGE上，與不同pH值的0.1 mol/L PB緩沖溶液中電化學響應進行了考察，結果圖4A所示。

圖3 A：以0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH=4.0)為底液，不同的掃描速率(從內到外依次是：25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350和375 mV/s)，5.0×10-4 mol/L撲熱息痛在PCR/PGE上的線性掃描伏安圖；B：撲熱息痛氧化峰電流和掃描速率的線性關系圖；C：撲熱息痛氧化峰電位和掃描速率自然對數的線性關系圖Fig.3 A: Linear scanning voltammograms of 5.0×10-4 mol/L paracetamol on PCR/PGE in 0.1 mol/L PB buffer solution (pH=4.0) at different scan rates (the scan rates from inner to outer are 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 and 375 mV/s, respectively); B: Linear relationship between the oxidation peak currents and scan rates; C: Linear relationship between the oxidation peak potentials and the common logarithm of scan rate.

圖4 A：不同pH值的0.1 mol/LPB溶液中，5×10-4 mol/L撲熱息痛在PCR/PGE上的循環(huán)伏安圖(掃描速率：100 mV/s)；B：撲熱息痛氧化峰電流與底液pH值之間的關系；C：撲熱息痛氧化峰電位與底液pH值之間的線性關系Fig.4 A: Cyclic voltammograms of 5.0×10-4 mol/L paracetamol on PCR/PGE in 0.1 mol/L PB solution with different pH value；B: Relationship between oxidation peak current of paracetamol and pH value；C: Linear relationship between oxidation peak potential of paracetamol and pH value

由圖4A可知，底液pH值會顯著影響撲熱息痛在PCR/PGE上的電化學反應。當底液的pH值從2.0～10.0逐漸增大時，撲熱息痛在PCR/PGE上的氧化峰電流先是逐漸升高，在底液pH值為4.0時，達到最大，之后又開始降低(圖4B)。因此，本研究中選擇pH為4.0的0.1 mol/L PB溶液作為檢測底液。此外，隨著底液pH值的升高，撲熱息痛其氧化峰電位開始負移，且與pH值之間具有較好的線性關系(圖4C)：EP=0.748 3-0.046 7pH(R2=0.996)，表明有質子參與了撲熱息痛在PCR/PGE上電化學反應的過程，由關系式Ep=K0.059(m/n)pH(式中K是常數，m是反應中轉移質子數，n是轉移電子數)可得，當撲熱息痛電化學反應在PCR/PGE上發(fā)生時，轉移的質子數等于電子數。由此可知，撲熱息痛在PCR/PGE上電化學反應為一個涉及兩質子兩電子的準可逆過程。推想其反應方程式為：

2.5 傳感器性能評價

2.5.1 傳感器的線性范圍和檢出限

采用方波伏安法，對此電化學傳感器的線性范圍與檢出限進行了考察，其結果如圖5A所示，數據分析可知，當撲熱息痛的濃度逐漸增大時，在PCR/PGE上，其氧化峰電流也隨著增大，且在1.0×10-5～9.0×10-4mol/L濃度，與其濃度呈現良好的線性關系，線性回歸方程為Ip=0.50+6.89c，R2=0.996(圖5B)。當S/N=3時，可經實驗測得傳感器的檢出限是2.0×10-6mol/L。

2.5.2 重現性

為了進一步對傳感器性能進行評價，實驗借助循環(huán)伏安方法，考察了PCR/PGE穩(wěn)定性與重現性。放置15 d后，對傳感器進行了平行測試，檢測信號仍可維持在初始信號的92%，表明傳感器的穩(wěn)定性良好。用一支PCR/PGE對20 μmol/L撲熱息痛平行測定8次，相對標準偏差(RSD)為2.0%，如圖6A所示；用8支PCR/PGE對20 μmol/L撲熱息痛進行平行測定，其相對標準偏差(RSD)為2.7%，如圖6B所示，表明傳感器的重現性良好。

圖5 A：不同濃度的撲熱息痛在PCR/PGE上的方波伏安圖；B：撲熱息痛的氧化峰電流和濃度的線性關系圖Fig.5 A: Square wave voltammograms of different concentrations of paracetamol on PCR/PGE；B: Linear relationship between the oxidation peak current of paracetamol and its concentration

圖6 A：一支PCR/PGE對20 μmol/L撲熱息痛平行測定8次；B：8支PCR/PGE對20 μmol/L撲熱息痛進行平行測定Fig.6 A: Parallel determination of 20 μmol/L paracetamol with one PCR/PGE for eight times；B: Parallel determination of 20 μmol/L paracetamol with eight different PCR/PGEs

2.5.3 準確性

取1片對乙酰氨基酚片(標準量0.65 g/tablet)，置于瑪瑙研缽中研碎，用無水乙醇充分洗滌并配制成100 mL樣品液，借助方波伏安法對其電化學響應進行測定，計算濃度則利用標準曲線法，由算得的濃度計算藥片中撲熱息痛含量，平行測試6次，利用標準加入法對回收率進行檢測，結果如表1所示。6次測定的回收率平均值為101.6%，測得結果與樣品撲熱息痛的含量接近，表明該傳感器具有良好的準確性。

表1 片劑藥品分析及回收率測試結果Tab.1 Tablet drug analysis and recovery test results

3 結語

研發(fā)了一種操作簡單、成本低廉的聚剛果紅修飾鉛筆芯電極，該修飾電極可顯著催化撲熱息痛的氧化反應，可用作撲熱息痛電化學傳感器。傳感器表面多孔疏松的結構可實現對撲熱息痛的有效富集，從而提高傳感器的靈敏度。研究過程中，對撲熱息痛電化學傳感的檢測條件進行了優(yōu)化，對撲熱息痛的電化學傳感機理進行了探討，并對傳感器的各項性能指標進行了評價。研發(fā)的撲熱息痛電化學傳感器，其優(yōu)勢在于較寬的線性范圍，高靈敏度，良好的重現性及穩(wěn)定性，具有簡易的制備方法，低成本，方便批量生產，可廣泛應用在生物醫(yī)學領域。