分子印跡固相萃取膜－高效液相色譜法檢測糧谷中腈菌唑殘留

王姣姣 龐 軍 劉 博 高文惠

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，石家莊 050000)

腈菌唑是一種高效、低毒、具有保護(hù)作用的內(nèi)吸殺菌劑，主要用來防治由黑星菌屬(Venturia)和核盤菌屬(Sclerotinia)引起的果樹病害，以及球腔菌屬(Mycosphaerella)引起的小麥等谷物病害和花生葉斑病。但是腈菌唑的不合理使用會造成農(nóng)藥殘留，進(jìn)而對人體和動物體內(nèi)分泌產(chǎn)生不良影響，主要表現(xiàn)在損害神經(jīng)系統(tǒng)，降低生物體的免疫能力并誘發(fā)腫瘤等。

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，MIT)是制作能夠特異性吸附模板物質(zhì)的一項尖端技術(shù)。分子印跡的核心就是制備出具有高選擇性分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)，其他一切應(yīng)用都是圍繞MIPs進(jìn)行的［1］。近幾年分子印跡技術(shù)主要集中于應(yīng)用研究，如在色譜分離［2－3］、固相萃?。?－7］、傳感器［8－11］等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

目前研究分子印跡固相萃取技術(shù)主要集中于分子印跡固相萃取柱的制備與應(yīng)用方面，而對于分子印跡固相萃取膜(molecularly imprinted solid phase extraction membrane，MISPEM)的研究鮮見報道［12－13］。本試驗通過原位聚合法制備腈菌唑分子印跡固相萃取膜，并應(yīng)用于食品中腈菌唑殘留的檢測。分子印跡膜不僅具有傳統(tǒng)膜技術(shù)的穩(wěn)定性、連續(xù)性和節(jié)能性的優(yōu)點，而且同時具備新興分子印跡技術(shù)預(yù)定性、選擇性和專一性的特點，采用分子印跡固相萃取膜對復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行前處理具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微孔濾膜(0.45μm尼龍膜):上海市新亞凈化器件廠;腈菌唑(myclobutanil，純度97.7%):江蘇耕農(nóng)化工有限公司;丙烯酰胺(AM，分析純):天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析純):撫順安信化學(xué)有限公司;偶氮二異丁腈(AIBN，化學(xué)純):天津市大茂化學(xué)試劑廠;甲醇、乙腈(色譜純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

大米、小麥、黑米等樣品:市售。

100μg/mL腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:準(zhǔn)確稱取2.5 mg腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.2 儀器與設(shè)備

LC－20A高效液相色譜儀:日本島津公司;TU－1810紫外可見分光光度計:北京普析通用有限責(zé)任公司;KH5200型超聲波清洗器:昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;HH－4型恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市宏華儀器廠。

1.3 采用紫外光譜法選擇致孔劑

稱取適量的腈菌唑，分別用乙腈、四氫呋喃和乙酸乙酯溶解，配制成濃度1 mmol/L溶液。當(dāng)乙腈作為致孔劑時，在腈菌唑的乙腈溶液中分別加入一定量的AM乙腈溶液，配成模板物質(zhì)與功能單體濃度比為 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，以四氫呋喃和乙酸乙酯為致孔劑的溶液配制同上，用對應(yīng)致孔劑為空白，測定其紫外光譜變化。

1.4 腈菌唑分子印跡固相萃取膜的制備

將0.2 mmol腈菌唑和0.4 mmol丙烯酰胺(AM)置于50 mL的圓底燒瓶中，加致孔劑乙腈15 mL，超聲1 h，再加交聯(lián)劑 EDMA 1.5 mL和引發(fā)劑 AIBN 0.02 g，將尼龍膜浸入液體內(nèi)，超聲30 min，把膜取出置于2片載玻片中間并固定2個載玻片位置，將載玻片放入自制真空瓶內(nèi)，通入N2脫氧15 min，抽真空1 min后密封，在55℃恒溫水浴鍋中靜置24 h，得到含模板物質(zhì)的分子印跡固相萃取膜。將該分子印跡膜用甲醇∶乙酸(體積比95∶5)洗脫至無模板物質(zhì)，再用甲醇浸泡1 h除去殘留的乙酸，將浸泡后的分子印跡膜干燥6 h，即得到腈菌唑分子印跡固相萃取膜。

1.5 樣品的提取

分別稱取5.000 g樣品(小麥、大米或黑米)，搗碎、研磨，用20 mL乙腈提取(分2次提取)，混勻，在常溫下超聲提取15 min，于4 000 r/min離心10 min，吸取上清液1 mL過自制的腈菌唑分子印跡固相萃取膜，用5 mL水淋洗，待排凈淋洗液后，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，并用甲醇定容至3 mL經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，待用液相色譜儀測定。

1.6 色譜條件

色譜柱:Promosil C18(4.6 ×150 mm，5 μm)，檢測波長210 nm，流動相為甲醇－水(體積比80∶20)，流速1 mL/min，柱箱溫度為25℃，進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備MIP時致孔劑選擇研究

腈菌唑的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，它在不同極性的溶劑中紫外吸收光譜有所不同。在乙腈中隨著腈菌唑與AM濃度比的增加，溶液最大吸收波長發(fā)生紅移，從196 nm紅移到200 nm，紅移量為4 nm，而且從圖2a可知隨著AM加入量增加溶液吸收強(qiáng)度增大，結(jié)果表明腈菌唑與AM之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的分子間作用力。

圖1 腈菌唑結(jié)構(gòu)式

圖2 在不同致孔劑中不同濃度比的腈菌唑與AM的紫外掃描圖

在四氫呋喃中隨著腈菌唑與AM濃度比增加，溶液最大吸收波長也發(fā)生紅移，由228 nm紅移到230 nm，紅移了2 nm;從圖2b可知，隨著AM加入量增加，溶液的吸收峰略有增強(qiáng)，結(jié)果表明腈菌唑與AM之間也產(chǎn)生了分子間作用力，但作用力的強(qiáng)度比上述情況弱。

由圖2c可知，在乙酸乙酯中，隨著腈菌唑與AM濃度比增加，溶液最大吸收波長未發(fā)生紅移，而且隨著AM加入量增加，溶液的吸收強(qiáng)度也未發(fā)生變化。結(jié)果表明，當(dāng)乙酸乙酯作為致孔劑時，腈菌唑與AM之間未發(fā)生明顯的分子間作用力。綜上所述，本試驗選擇乙腈為制孔劑。

2.2 分子印跡膜印跡次數(shù)對液體通過性的影響

分子印跡膜是通過原位聚合法在尼龍絲網(wǎng)上形成分子印跡聚合物，這種采用尼龍為基材的方法大大加強(qiáng)了膜的機(jī)械強(qiáng)度，使膜可以重復(fù)使用，經(jīng)重復(fù)萃取試驗結(jié)果表明，該膜可以連續(xù)萃取30次，而性能不衰減，如圖3所示，但是聚合物的形成會造成尼龍膜孔穴不同程度的堵塞。試驗考察了在膜上聚合一次和兩次對液體通過性的影響。研究結(jié)果表明，在膜表面印跡2次，其通過性較差，需使用較大的壓力才能使液體通過膜，且流出液渾濁，這是由于壓力過大印跡聚合物脫落所致。在尼龍膜表面印跡2次的印跡膜，其通過性良好，重力作用就可以使液體通過，且流出液無渾濁現(xiàn)象。故試驗采用1次印跡制備分子印跡固相萃取膜。

圖3 分子印跡固相萃取膜制備示意圖

2.3 淋洗液和淋洗液用量的選擇

本試驗考察了乙腈和水作為淋洗液時對樣品凈化效果的影響。將100μg/mL的腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣1 mL，分別采用乙腈和水淋洗，將收集到的各淋洗液按照1.6色譜條件進(jìn)行測定。試驗結(jié)果表明，乙腈可將模板物質(zhì)淋洗下來，不適合作為淋洗液。水作淋洗液無此現(xiàn)象。

選用水作為淋洗液，分別用1、3、5 mL水淋洗時，其流出液上機(jī)測定有響應(yīng)，但無腈菌唑物質(zhì)峰出現(xiàn)，表明水可以將雜質(zhì)洗去，但不會將模板物質(zhì)淋洗下來，適合作為淋洗液;當(dāng)用大于5 mL水淋洗之后上機(jī)檢測無響應(yīng)信號，說明已將雜質(zhì)淋洗完全，所以本試驗采用5 mL水作為最佳淋洗液用量。

2.4 洗脫劑和洗脫劑用量的選擇

試驗考察了甲醇和乙腈分別作為洗脫劑對印跡膜中目標(biāo)物腈菌唑洗脫效果的影響。將100μg/mL的腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL上樣，并進(jìn)行洗脫，將收集到的洗脫液上機(jī)進(jìn)行測定。結(jié)果表明甲醇作為洗脫劑時腈菌唑的峰面積大于乙腈作為洗脫劑時的峰面積，由此可知，甲醇的洗脫效果比乙腈好，因此選擇甲醇為洗脫劑。

取1 mL 100μg/mL腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液過自制分子印跡固相萃取膜，分別選取

1、3、5 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液上機(jī)檢測。結(jié)果為當(dāng)收集到的洗脫液大于3 mL時，已經(jīng)檢測不到腈菌唑，說明3 mL甲醇可以將模板物質(zhì)洗脫完全。故洗脫劑用量為3 mL。

2.5 檢測波長的選擇

對腈菌唑進(jìn)行紫外光譜掃描，以確定液相色譜的檢測波長。由掃描結(jié)果可知腈菌唑的最大吸收波長為196 nm，但甲醇在190～208 nm之間有吸收，綜合考慮，選擇210 nm為最佳檢測波長。

2.6 流動相的選擇

采用甲醇－水混合溶液作為流動相，考察了甲醇 －水體積比分別為 100∶0、90∶10、80∶20和 70∶30時腈菌唑的保留情況。結(jié)果表明，當(dāng)流動相比例為80∶20時，腈菌唑的保留值適宜，分析時間較短，見圖4所示。因此選擇體積比為80∶20的甲醇－水作為流動相。

圖4 腈菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.7 線性關(guān)系與檢出限

將腈菌唑分別配制成質(zhì)量濃度為 0.3，0.5，1，2，5，10，20，50，100 μg/mL 的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 1.6色譜條件下進(jìn)行測定，并繪制腈菌唑的線性關(guān)系曲線。其線性關(guān)系和檢出限見表1。

表1 線性方程、線性關(guān)系及檢測限

2.8 腈菌唑分子印跡固相萃取膜對樣品的凈化和吸附作用

分子印跡固相萃取膜是利用非共價鍵作用對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行吸附，通過淋洗液將雜質(zhì)去除，然后利用洗脫液將目標(biāo)物洗脫下來。由圖5a、圖5b和圖6a、圖6b可知，分子印跡固相萃取膜對樣品凈化效果好，對雜質(zhì)不具有吸附能力。由圖5c和圖6c可知，分子印跡固相萃取膜對模板物質(zhì)表現(xiàn)出高選擇性吸附能力，表明它從復(fù)雜基質(zhì)中富集目標(biāo)物的優(yōu)越性能。

圖5 腈菌唑MISPEM對黑米樣品凈化和吸附效果的色譜圖

圖6 腈菌唑MISPEM對小麥樣品凈化和吸附效果的色譜圖

2.9 方法回收率和精密度試驗

在最佳試驗條件下對大米、小麥和黑米樣品在0.5μg/mL和5μg/mL 2個添加水平下，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，分析結(jié)果如表2所示，平均回收率在80.2% ～86.0% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.2%～3.3%之間(n=5)。結(jié)果表明該方法的回收率和精密度良好。

表2 樣品的回收率和精密度試驗(n=5)

3 結(jié)論

采用原位聚合法制備出腈菌唑分子印跡固相萃取膜，通過紫外光譜試驗考察了制備印跡膜時致孔劑的選擇，同時考察了分子印跡膜印跡次數(shù)對液體通過性的影響，最后將其應(yīng)用到糧谷樣品的前處理，建立了腈菌唑分子印跡固相萃取膜－高效液相色譜法檢測糧谷中腈菌唑殘留的方法。試驗結(jié)果表明，當(dāng)乙腈作為致孔劑時，腈菌唑與AM之間產(chǎn)生了較強(qiáng)的分子間作用力，并且在尼龍膜表面印跡一次的印跡膜，其通過性良好，在0.3～20μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤3.3%(n=5)，平均回收率在80.2% ～86.0%之間，檢出限為1.2μg/g，與傳統(tǒng)的固相萃取相比，腈菌唑分子印跡固相萃取膜能夠有效地去除糧谷樣品中的雜質(zhì)，并且選擇性富集糧谷樣品中腈菌唑殘留。該方法靈敏、可靠，適用于糧谷樣品中腈菌唑殘留的分析。

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