豬博卡病毒（重慶株）NP1部分基因的克隆測序及生物信息學(xué)分析

葉星宇，聶 奎，聶福平

（1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 北碚400715；2.四川省廣元市動物疫病預(yù)防控制中心，四川 廣元628000；3.重慶市出入境檢驗檢疫局，重慶 江北400020）

2009年，瑞典的Blomstroem等人從患PMWS病豬的淋巴結(jié)中分離得到一株新的細(xì)小病毒，將其暫命名為豬博卡樣病毒（Porcine Boca-like Virus）[1]。隨后，通過對其接近全長的基因組進(jìn)行擴(kuò)增和測序，證明了該病毒屬于博卡病毒屬，與犬博卡病毒的親緣關(guān)系較近，因此正式命名為豬博卡病毒（Porcine Bocavirus，PBoV）[2]。目前在歐洲、北美、中國、中國香港已經(jīng)有PBoV感染豬群的報道，并且PBoV在患病豬中的感染率高于健康豬中的感染率，因而推測PBoV可能與某些病原體起到協(xié)同致病的作用。但幸運(yùn)的是，至今尚未見有PBoV感染人的報道。

研究證實，PBoV為單股線狀DNA，其基因組大小為5.2 kb左右，包含3個開放閱讀框，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1），ORF2編碼2個衣殼蛋白（VP1和VP2），中間開放閱讀框（ORF3）編碼一個高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)（Nuclear Protein 1，NP1）[3-4]。穩(wěn)定的NP1基因為博卡病毒所特有，對于NP1遺傳進(jìn)化的研究有助于了解PBoV在國內(nèi)豬群的流行的傳染源以及其遺傳變異規(guī)律，為PBoV的科學(xué)防控提供參考。本試驗通過設(shè)計一對特異性引物，對重慶地區(qū)豬群中豬博卡病毒部分NP1基因進(jìn)行克隆及遺傳變異分析，報告于下。

1 材料與方法

1.1 血清來源 血液樣本采自重慶市某規(guī)模養(yǎng)殖場，離心后分離血清，分裝并置于-20℃凍存?zhèn)錂z。

1.2主要試劑 DNA提取試劑盒、r Taq DNA聚合酶、DNA片段回收試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞JM109、pMD19-T載體試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒，購自O(shè)mega公司；氨芐青霉素（Amp），購自Invitrogen公司。

1.3引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank已公布的PBoV-NP1基因序列，利用DNAStar和Primer 5.0軟件在其保守序列設(shè)計一對特異性引物。上游引物PBoV-F：5'-AAGGACATCTCCGAAAC-3'，下游引物PBoV-R：5'-ATGAATGCCAGTGAAA-3'，預(yù)計擴(kuò)增片段大小為257 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 病原體DNA抽提和PCR擴(kuò)增 按TaKaRa公司（大連）的病毒基因組提取試劑盒說明書，從豬血清提取病毒DNA。以提取的DNA樣品為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30 s、56℃30 s、72℃60 s，共40個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆與測序 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pMD19一T載體進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)12 h，挑取上述轉(zhuǎn)化平皿中的白色菌落，接種到含有Amp（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜至混濁，提取質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.6 生物信息學(xué)分析 從GenBank獲取已公布的PBoV序列及HBoV、PPV序列（見表1），并對本試驗的PboV-NP1（CQRC1-7）基因序列與公布的PBoV基因序列及HBoV、PPV基因序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 NP1部分基因的克隆 用PCR方法擴(kuò)增出PBoV-NP1部分基因片段，大小約為257 bp，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

表1 本試驗中用于PBoV系統(tǒng)進(jìn)化分析的序列信息

圖1 重慶地區(qū)部分豬血清樣本PBoV的PCR檢測結(jié)果

2.2 PBoV-NP1基因核苷酸序列分析

2.2.1 PBoV-NP1基因序列同源性比較 測得7個豬博卡病毒重慶株NP1部分基因片段序列，擬命名PboV-NP1（CQRC1-7）。測序結(jié)果顯示，PboVNP1（CQRC1-5）及PboV-NP1（CQRC7）與PBoV瑞典標(biāo)準(zhǔn)株GU902968序列完全一致，PBoV-NP1（CQRC6）在NP1基因的第236位堿基及第269位堿基與GU902968僅有2個堿基不同（圖2）。

CQRC1-7與PBoV瑞典株GU902968同源性為99.2%-100%，CQRC-6與CQRC1-5及CQRC-7僅有2個堿基不同，同源性為99.2%。CQRC1-7與其他PBoV瑞典株及中國株的同源性均在97.3%以上，CQRC1-7與HBoV瑞典株同源性僅為32.3%～34.6%，與PPV的同源性較低，表明本試驗擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的基因較為保守（圖3）。

圖2 PBoV-NP1（CQRC1-7）與PBoV瑞典標(biāo)準(zhǔn)株NP1部分基因序列比對

圖3 豬博卡病毒NP1部分基因同源性比較

2.2.2 PBoV-NP1基因遺傳變異分析 PBoV-NP1（CQRC1-7）基因遺傳變異分析結(jié)果顯示，PBoVNP1（CQRC1-7）與HBoV st1株形成一簇，3株P(guān)PV NADL-2株與PPV中國株親緣關(guān)系很近，但其與博卡病毒屬成員的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，所以這4株P(guān)PV聚在一起形成另一簇；PBoV-NP1（CQRC1-7）與GenBank公布的9個PBoV瑞典株及中國株在一個分支上，HBoV st1株單獨形成一個分支；其中，PBoV-NP1（CQRC1-5）及PBoV-NP1（CQRC7）與PBoV瑞典株（GU902968）親緣關(guān)系非常近，聚在一個分支上，PBoV-NP1CQRC6與PBoV-NP1（CQRC1-5）及PBoV-NP1（CQRC7）屬于不同的分支。PBoV-NP1（CQRC1-7）與PBoV瑞典株及中國株在同一分支上，表明PBoV的NP1基因遺傳變異較小（圖4）。

圖4 豬博卡病毒NP1基因發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 PBoV-NP1基因氨基酸序列分析 PBoV瑞典株sw90_1株NP1基因推導(dǎo)，NP1蛋白全長218個氨基酸，本次試驗獲得的基因片段編碼NP1基因第30位點至111位點的82個氨基酸，根據(jù)16株P(guān)BoV的NP1基因的核苷酸序列推導(dǎo)了其所編碼的氨基酸序列。結(jié)果顯示，各毒株氨基酸序列之間比較，共有10個位點的氨基酸發(fā)生了變異，同源性在87.8%～100%之間。

3 討論

2010年，Blomstroem等發(fā)現(xiàn)了PBoV的一段編碼218個氨基酸的開放閱讀框，并證實為NP1基因，且與人類博卡病毒NP1基因序列相近，基因組兩端具有2個分別編碼NS蛋白和NP蛋白的開放閱讀框NP1基因具有較好的穩(wěn)定性，是成為疫苗和藥物作用的良好靶點[5]。通過對本次試驗分離的7個病毒株NP1部分基因的測序與分析，發(fā)現(xiàn)7個PBoV-NP1部分基因片段其與NCBI公布的PBoV序列同源性達(dá)到97.3%～100%，其中與瑞典標(biāo)準(zhǔn)株（GU902968）同源性最高，為99.2%～100%，表明重慶地區(qū)流行的豬博卡病毒可能與PBoV標(biāo)準(zhǔn)株的親緣關(guān)系很近，推測重慶地區(qū)豬群中感染的PBoV可能是通過國外品種引進(jìn)或者進(jìn)口國外動物性產(chǎn)品而傳播感染豬群,因此，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)國外引種及進(jìn)口動物性產(chǎn)品的檢驗檢疫，加強(qiáng)境岸檢疫，防止特定病原傳入國內(nèi)。該試驗也表明PBoV的NP1基因核酸序列可能比較保守，遺傳進(jìn)化速度較慢，與同科的其他病毒做遺傳變異分析，形成相對獨立的一個分支，為豬博卡病毒NP1基因功能的進(jìn)一步研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]Blomstrom A，Belak S，F(xiàn)ossum C，et al.Detection of a novel porcine bocalike virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postewaningmultisystemic wasting syndrome[J].Virus Research，2009，146：125-129.

[2]Blomstrom A，Belak S，F(xiàn)ossum C，etal.Studies of porcine circovirus type 2，porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence ofmultiple viral infections in postweaningmultisystemic wasting syndrome pigs[J].Virus Research，2010，152：59-64.

[3]林峰，曾愛平，楊恩，等.WLL-1株博卡病毒（Boeavirus）全基因組序列分析[J].病毒學(xué)報，2007，23（1）：1-3．

[4]羅迪賢，劉巧突，林應(yīng)標(biāo)，等.人類博卡病毒基因組序列與進(jìn)化分析[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，13（6）：1430-1432.

[5]曾松林.豬新型細(xì)小病毒PHoV和PBoV診斷方法的建立、分子流行病學(xué)調(diào)查及基因組序列分析[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：4-5.