微波輔助酶法提取姜黃中姜黃素的工藝研究

寧娜,韓建軍,胡宇莉,鄒宗堯,郁建生

(1.銅仁職業(yè)技術學院 藥學院，貴州 銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 401120；4.西南大學 藥學院，重慶 400715)

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微波輔助酶法提取姜黃中姜黃素的工藝研究

寧娜1,2,韓建軍1,2,胡宇莉3,鄒宗堯4,郁建生1,2

(1.銅仁職業(yè)技術學院 藥學院，貴州 銅仁 554300；2.貴州省中獸藥工程研究中心，貴州 銅仁 554300；3.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶 401120；4.西南大學 藥學院，重慶 400715)

為了研究微波輔助酶法提取姜黃中姜黃素的工藝，以姜黃素收率為考核指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法對姜黃素提取工藝進行優(yōu)化。優(yōu)選姜黃素的最佳酶解輔助提取工藝為：酶用量9.8 mg/g，酶解時間75 min，酶解pH值4.7，酶解溫度43 ℃。所建立的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行，為進一步工業(yè)化生產提供理論依據。

姜黃；姜黃素；纖維素酶；微波法；提取工藝

姜黃為姜科植物姜黃CurcumalongaL.的干燥根莖，其性溫味苦、辛，具有破血行氣、散結止痛之功效，主治氣滯血瘀、胸腹疼痛、風濕痹痛等癥[1]。姜黃含有姜黃素類物質、揮發(fā)油、無機元素等成分，其中姜黃素是姜黃藥材質量控制的指標成分[1-2]。研究表明姜黃素可提高患子宮內膜炎奶牛的免疫力[3]、提高肉仔雞的生長性能和免疫功能[4]、提高育肥豬的日增重、降低料重比，同時提高瘦肉率[5]等作用。

已經報道的姜黃提取方法有滲漉法[6]、回流法[6]、超聲法[7]、微波法[8]等。其中，微波法是利用微波加熱與藥材相接觸的溶劑，促進目標成分從藥材中轉移至溶劑中一個過程，具有高效、節(jié)能、污染小的特點[9]。生物酶解技術是一種新興的植物有效成分提取方法，其利用酶反應使植物細胞壁及間質中的組成成分發(fā)生降解，從而降低溶劑傳質阻力，促進有效成分的釋放，具有收率高、反應條件溫和且易于控制等特點[10]。基于上述優(yōu)點，已有學者將微波法和酶解技術聯合起來應用于綠原酸[11]、姜辣素[12]、橙皮苷[13]等成分的提取中。目前微波輔助酶法應用于姜黃中姜黃素的提取研究尚未見報道。本文將微波輔助酶法應用于姜黃中姜黃素的提取中，并通過響應面分析法得到微波輔助酶解提取的最佳工藝，為姜黃中姜黃素在獸醫(yī)臨床上的深入開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent高效液相色譜儀美國Agilent公司；pHS-3C精密pH計上海雷磁儀器廠；RE-2000A旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；METTLER AE240十萬分之一電子天平,德國梅特勒公司；LWMC-201型微波化學反應器,南京旋光科技有限公司。

1.2 藥品與試劑 姜黃素對照品,中國食品藥品檢定研究院，純度為98.9%；姜黃藥材,成都荷花池中藥材市場，經本院梁玉勇教授鑒定；纖維素酶,天津利華酶制劑技術有限公司，酶活力為10 000 U/g；水為重蒸水；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 姜黃素含量檢測方法

1.3.1.1 色譜條件 參考《中華人民共和國獸藥典》[1]，具體色譜條件為：Kromasil-C18柱(4.6 mm×150.0 mm，5 μm)；流動相：乙腈-1%冰醋酸(48∶52)；流速：1.0 mL/min；柱溫：28℃；檢測波長：430 nm；進樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數以姜黃素峰計算不低于4000。

1.3.1.2 姜黃素的提取 微波輔助酶法提取姜黃中姜黃素的提取工藝流程如下：姜黃→干燥、粉碎成粗粉(過40目篩)→纖維素酶解→微波提取→合并提取液→減壓濃縮至100 mL→測定姜黃素含量。通過參考文獻[8]及結合預試驗結果，確定微波提取姜黃素的工藝條件為：乙醇濃度75%、微波功率390 W、微波時間 60 s、料液比1∶25。

1.3.1.3 姜黃素收率的計算 精密吸取姜黃素濃縮提取液0.5 mL至50 mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計算姜黃素含量，并計算姜黃素收率，姜黃素收率計算公式為：姜黃素收率(mg/g)=提取液中姜黃素含量(mg)/藥材質量(g)。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶用量 準確稱取10 g姜黃粉末，加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在酶解時間60 min、酶解pH值 4.5、酶解溫度45 ℃的條件下，考察不同酶用量(6、8、10、12、14 mg/g)對姜黃素收率的影響。

1.4.2 酶解時間 準確稱取10 g姜黃粉末，加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在酶用量10 mg/g、酶解pH值 4.5、酶解溫度45 ℃的條件下，考察不同酶解時間(20、40、60、80、100 min)對姜黃素收率的影響。

1.4.3 酶解pH值 準確稱取10 g姜黃粉末，加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在酶用量10 mg/g、酶解時間60 min、酶解溫度45 ℃的條件下，考察不同酶解pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)對姜黃素收率的影響。

1.4.4 酶解溫度 準確稱取10 g姜黃粉末，加入100 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在酶用量10 mg/g、酶解時間60 min、酶解pH值 4.5的條件下，考察不同酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)對姜黃素收率的影響。

1.5 響應面法優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，以姜黃素收率為考察指標，對酶用量、酶解時間、酶解pH值、酶解溫度進行4因素3水平實驗設計，對提取條件進行優(yōu)化，試驗因素水平安排見表1。

表1 Box-Behnken設計因素及水平

2 結果與分析

2.1 姜黃素的HPLC測定結果 在1.3.1.1項色譜條件下測定姜黃素標準品及姜黃藥材得到的色譜圖見圖1。峰面積Y與姜黃素濃度X(μg/mL)的回歸方程為：Y=139376.81X-28914.74(R2=0.9998)，線性范圍為：4.12～41.20 μg/mL。

圖1 姜黃素標準品(A)和姜黃藥材(B)的高效液相色譜圖

2.2 姜黃素提取單因素試驗結果

2.2.1 酶用量 不同酶用量對姜黃素收率的影響見圖2。結果表明，姜黃素收率隨著纖維素酶用量的增加先增大后減小。纖維素酶用量為10 mg/g時，姜黃素收率最大。

圖2 酶用量對姜黃素收率的影響

2.2.2 酶解時間 不同酶解時間對姜黃素收率的影響見圖3。試驗結果表明，姜黃素收率隨著酶解時間的延長而升高。當酶解時間超過60 min后，姜黃素收率的增加趨于平緩。

圖3 酶解時間對姜黃素收率的影響

2.2.3 酶解pH值 不同酶解pH值對姜黃素收率的影響見圖4。試驗結果表明，姜黃素收率隨著酶解pH值的增大先增大后減小。酶解pH值為4.5時，姜黃素收率最大。

圖4 酶解pH值對姜黃素收率的影響

2.2.4 酶解溫度 不同酶解溫度對姜黃素收率的影響見圖5。試驗結果表明，姜黃素收率隨著酶解溫度的升高先增大后減小。酶解溫度為45℃時，姜黃素收率最大。

圖5 酶解溫度對姜黃素收率的影響

2.3 響應面試驗優(yōu)選最佳工藝條件

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

續(xù)表

表3 回歸方程的方差分析

2.3.2 響應面分析 響應面圖可直觀反映各因素之間的交互作用，姜黃素提取工藝參數中酶用量、酶解時間、酶解pH值、酶解溫度4個因素之間交互作用對姜黃素收率的影響如圖6所示。圖6中響應曲面均為開口向下的凸形曲面表明存在考察的范圍內響應值(姜黃素收率)的極高值。響應面圖的陡峭程度可反映各因素交互作用的強弱及影響程度，響應面圖陡峭則表示兩因素交互作用影響大。通過分析圖6中響應面圖可知，酶用量與酶解時間、酶用量與酶解pH值、酶用量與酶解溫度、酶解時間與酶解pH值對姜黃素收率影響最大，其次是酶解pH值與酶解溫度，而酶解時間與酶解溫度對姜黃素提取率影響最小。

圖6 兩兩因素交互作用對姜黃素收率影響的響應面圖

2.3.3 最佳工藝條件的確定及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，得到最佳酶解工藝條件為：酶用量9.80 mg/g、酶解時間75.25 min、酶解pH值4.68、酶解溫度42.83 ℃，在此條件下，姜黃素的理論收率為22.10 mg/g?？紤]到操作的便利，確定最佳酶解工藝條件為：酶用量9.8 mg/g，酶解時間75 min，酶解pH值4.7，酶解溫度43 ℃。在該工藝條件下，對姜黃進行3次平行提取試驗，即將姜黃藥材按照擬定的酶解工藝條件進行酶解預處理后，再進行微波提取，測得姜黃素收率為21.96 mg/g，RSD=0.47%(n=3)，試驗結果與模型預測相對誤差僅為0.63%。

3 討論與小結

姜黃主產于我國四川、云南、廣西、廣東、福建等地。姜黃的傳統(tǒng)提取方法(如滲漉法、回流法、溫浸法)存在耗時長、有機溶劑用量大等缺點，本研究基于微波法和酶法在提取中藥時的優(yōu)點，首次將微波輔助酶法應用于中姜黃的提取中，即在常規(guī)微波提取的基礎上，加入酶解預處理步驟，以期達到高效從姜黃中提取姜黃素的目的。

在單因素試驗中，就酶用量而言，隨著姜黃素收率隨著酶用量的增加而增大，當酶用量達到10 mg/g后，隨著酶用量的進一步增加而呈下降趨勢，這是由于隨著酶用量的增加，促進了酶對姜黃藥材植物細胞壁的降解，增加了姜黃素的溶出，當酶用量超過10 mg/g之后，酶與底物的作用點已經達到飽和，繼續(xù)增加酶用量，使酶過于擁擠而包裹住姜黃藥材顆粒，從而阻礙姜黃素的溶出；就酶解時間而言，姜黃素收率隨著酶解時間的延長而明顯增大，當酶解時間超過60 min后，隨著酶解時間的進一步延長而無明顯增加；就酶解pH值而言，姜黃素收率隨著酶解pH值的增大而增大，當時酶解pH達到4.5后，隨著酶解pH值的進一步升高而呈下降趨勢，這是由于酶解pH值高于或低于酶的最適pH值均會影響酶的催化活力，從而影響姜黃素收率；就酶解溫度而言，姜黃素收率隨著酶解溫度的升高而增大，當時酶解溫度達到45 ℃后，隨著酶解溫度的進一步升高而呈下降趨勢，這是由于酶屬于蛋白質，其活性受酶解溫度的影響，當酶解溫度低于其最適溫度時，溫度升高可促進其酶活性的增強，而當溫度超過其最適溫度值時則可引起酶蛋白的變性甚至失活，從而降低酶的催化活力，影響姜黃素收率。

通過響應面試驗優(yōu)選到的姜黃藥材最佳酶解工藝為：酶用量9.8 mg/g，酶解時間75 min，酶解pH值4.7，酶解溫度43 ℃。姜黃藥材在該條件下酶解后，再進行微波提取(乙醇濃度75%、微波功率390 W、微波時間 60 s、料液比1:25)。所建立的提取工藝穩(wěn)定可行，與單一微波法相比[8]，姜黃素的提取效率有較大提高，與傳統(tǒng)提取法(滲漉法、溫浸法、回流法)[6]相比，微波輔助酶法提取工藝具有提取效率高、提取時間短、有機溶劑消耗量少等優(yōu)點，該提取工藝中的試驗條件容易控制、溶劑消耗量少、安全環(huán)保，為姜黃素的工業(yè)化大生產提供參考。

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(編輯：陳希)

Study on Microwave-assisted Enzyme Extraction Process for Curcumin fromCurcumalonga

NING Na1,2,HAN Jian-jun1,2,HU Yu-li3,ZOU Zong-yao4,YU Jian-sheng1,2

(1.DepartmentofPhamrmacy,TongrenVocationalandTechnicalCollege,Tongren,Guizhou554300,China; 2.EngineeringReserchCenterofVetrinaryTraditonalChineseMedicineinGuizhou,Tongren554300,China; 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofChongqing,Chongqing401120,China; 4.SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

Curcumin fromCurcumalongawas extracted by microwave-assisted enzyme extraction process.Based on the single factor experiment,the optimal extraction technology was optimized by response surface methodology with curcumin yield as the detective marker.The optimum extraction condition were as follows: cellulase dosage 9.8 mg/g,enzymolysis time 75 min,pH 4.7,enzymolysis temperature 43 ℃.The extraction process is reasonable and scientific,and it could be used in future large-scaled preparation.

Curcumalonga; curcumin; cellulase; microwave; extraction process

貴州省農業(yè)類工程技術研究中心項目(黔科合農G字[2015]4001號)

寧娜，博士，副教授。從事藥用資源的開發(fā)利用工作。E-mail: ningnaok@163.com

2015-11-04

A

1002-1280 (2015) 12-0020-07

S853.73