豆芽孵化時使用氯吡脲的效果及殘留風險

朱 勇，羅宗濤，周麗絨，吳銀良，江瀟瀟

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室 (寧波)，浙江寧波 315040;2.寧波市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，浙江寧波 315040)

豆芽是深受廣大消費者歡迎的食品，具有較高的營養(yǎng)價值。但因近年新聞媒體曝光市場豆芽存在的質(zhì)量安全隱患，如添加各類生長調(diào)節(jié)劑等，使豆芽質(zhì)量安全問題受到社會各界的廣泛關注。較為常見的添加劑為氯吡苯脲，是具有細胞分裂素活性的苯脲類植物生長調(diào)節(jié)劑，其生物活性卻較6-芐氨基嘌呤高10～100倍，能影響植物芽的發(fā)育，加速細胞有絲分裂，促進細胞增大和分化，防止果實和花的脫落的作用，從而促進植物生長、早熟、延緩作物后期葉片的衰老、增加產(chǎn)量，廣泛用于農(nóng)業(yè)，園藝和果樹［1-3］。中國登記的使用氯吡脲的農(nóng)作物有6種，分別為黃瓜、西瓜、甜瓜、葡萄、獼猴桃和枇杷［4］。在日常的豆芽監(jiān)測中，時有個別樣品檢出氯吡脲這一事實也證明個別豆芽生產(chǎn)商拓展用途，將氯吡脲用于豆芽生產(chǎn)。

生產(chǎn)過程中氯吡脲使用濃度與豆芽體內(nèi)殘留量之間的關系、殘留風險及快速檢測準確定性的方法研究都至關重要。

1 材料與方法

1.1 材料

WatersUPLC-XEVO超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，Acquity BHE C18色譜柱 (美國Waters公司);DYJ-S6031豆芽機 (廣東小熊電器有限公司);氯吡脲 (四川施特優(yōu)化工有限公司);氯吡脲標準品(CAS號:68157-60-8，SIGMA公司);無水甲醇、甲酸均為色譜純試劑 (德國merck公司)。

供試綠豆為購自超市的上海裕田農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)的禾煜牌綠豆，黃豆為購自種子公司的當年新豆。豆芽均在農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室 (寧波)實驗室內(nèi)采用小熊豆芽機 (DYJS6031)孵化。

1.2 UPLC條件

色譜條件。Acquity BHE C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm，內(nèi)徑1.7μm);流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件:流動相B在0.5 min內(nèi)保持20%，然后在2.5 min內(nèi)上升到80%，保持1.5 min;再在0.1 min內(nèi)降至20%，保持 1.4 min;流速 0.3 mL·min-1，進樣量10μL，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件。ESI源正負離子模式電離，多反應監(jiān)測 (MRM)，毛細管電壓2.0 kV，萃取錐孔電壓30 V，RF透鏡電壓0.5 V，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度500℃，錐孔氣流速50 L·h-1，脫溶劑氣流速1 000 L·h-1，倍增器電壓650 V，二級碰撞氣為氬氣，定性離子對m/z:248.2＞129.0*，248.2＞155.0(248.2為母離子，129.0為定量離子，129.0與155.0同為定性離子，*代表定量離子);錐孔電壓:24 V;碰撞能量:16，14 eV。

1.3 樣品制備

1.3.1 豆芽制作

綠豆芽、黃豆芽制作。分別稱取綠豆、黃豆各80 g，加水250 mL，浸泡3 h后，將豆均勻撒于豆芽機的培育盤上，豆芽機選擇“綠豆/黃豆，正?！边x項開機孵化，前5 h為泡豆階段，隔5 min噴水1次，5 h之后是培育時間，隔1 h噴水1次，噴水時間均為1 min，孵化水溫為26.4℃。上機后16，40 h，從培育盤中隨機選擇5顆豆芽，測量其芽長，然后將培育盤放入濃度梯度依次為0，0.02， 0.04， 0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.8 和1.0 mg·L-1的氯吡脲溶液中浸泡，浸泡時間1 min，再次上機孵化，64 h后等豆芽成熟后再次隨機選擇5顆豆芽，測量其芽長，然后采收稱重。

1.3.2 氯吡脲提取

豆芽樣品打漿后，稱取5 g樣品，加入10 mL甲醇，勻漿，以5 000 r·min-1離心3 min后吸取上清液200μL，與800μL甲酸溶液混合均勻，過0.22μm濾膜后進行LC-MS/MS分析。

1.4 標準曲線的測定

準確配制1.0，2.0，5.0，10.0和20.0μg·L-1的標準濃度工作液，進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，制作標準曲線。

2 結果與分析

2.1 方法的檢出限、回收率和精密度

在綠豆芽和黃豆芽空白樣品中添加標準溶液，添加3個濃度分別是0.01，0.10，1.00 mg·kg-1，每濃度添加3個樣品。按上述條件1.3.2進行樣品處理，按1.2進行樣品分析，測定加標回收率，考察方法的準確性和可靠性。結果表明，3個添加濃度的回收率分別為89.1%，81.9%和81.7%，均在70%～120%，批內(nèi)變異系數(shù)分別為4.2%，4.0%和 3.9%，均小于 10%，檢測限均為0.001 mg·kg-1，可滿足風險評估樣品監(jiān)測的要求。

2.2 豆芽中氯吡脲的分析結果

2.2.1 氯吡脲對綠豆芽的生長影響

從表1可知，與未使用氯吡脲的對照比較，孵化綠豆芽使用浸泡氯吡脲溶液濃度在0.02～1.00 mg·L-1，在生長初期16 h，由于綠豆芽還未浸泡氯吡脲，所以胚軸長度上相差不大，直徑也相差不大，此時胚根還未長出來;第1次浸泡后24 h(上機40 h，)再次測量，與對照相比胚根胚軸沒有更長反而有縮短的跡象;第2次浸泡后24 h(上機64 h)后，綠豆芽成熟，使用了氯吡脲的豆芽比對照組胚根和胚軸更短，豆芽更粗，隨著浸泡濃度的增加，胚根胚軸都有縮短的跡象，抑制效果明顯。將采收后的綠豆芽稱重，采用0.02 mg·L-1氯吡脲浸泡的綠豆產(chǎn)量最大，隨著浸泡濃度的增加，綠豆芽的產(chǎn)量均有一定程度的下降。這與朱杰麗等［5］在研究氯吡脲對楊梅果實生長時發(fā)現(xiàn)過高濃度反而對楊梅產(chǎn)生偏生、偏小、偏少的情況相吻合。

表1 氯吡脲對綠豆芽孵化的影響

2.2.2 氯吡脲對黃豆芽的生長影響

從綠豆芽的孵化結果來看，浸泡的氯吡脲濃度超過0.10 mg·L-1后，生長趨勢反而抑制，短小很多。

在黃豆芽試驗中，將氯吡脲的最高濃度設在0.10 mg·L-1。黃豆芽孵化使用的氯吡脲溶液濃度為0.02～0.10 mg·L-1，黃豆芽試驗的結果與綠豆芽相類似 (表2)。

表2 黃豆芽孵化時使用氯吡脲的試驗結果

在生長初期16 h，由于黃豆芽此時均未浸泡氯吡脲，所以胚軸長度上相差不大，直徑也相差不大，此時胚根還未長出來;在第1次浸泡后24 h(上機40 h，)再次測量，與對照相組比較其胚軸、胚根有縮短的跡象，但無規(guī)律;在第2次浸泡后24 h(上機64 h)黃豆芽成熟，浸泡了氯吡脲的黃豆芽比對照組胚軸變短，特別是浸泡濃度為0.10 mg·L-1時，縮短25%，胚根變化不大;但浸泡過氯吡脲后黃豆芽胚軸直徑均比對照組粗。低濃度的氯吡脲溶液能促進黃豆芽胚軸的伸長，但隨著氯吡脲濃度的增加，抑制效果明顯，反應在采收后的重量上，采用0.02 mg·L-1濃度浸泡后的黃豆產(chǎn)量最大，隨著浸泡濃度的增加，黃豆芽的產(chǎn)量均有一定程度的下降。

2.2.3 氯吡脲在豆芽的殘留風險

氯吡脲是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，據(jù)國內(nèi)外現(xiàn)有的毒理評估資料，對哺乳動物毒性低。氯吡脲對鼠的急性經(jīng)口LD50為4 902 mg·kg-1bw，屬于低毒;兔急性經(jīng)皮LD50≥ 2 000 mg·kg-1bw，也屬于低毒，鼠急性吸入LC50≥3.0 mg·L-1，屬于無毒;兔眼睛刺激性為中等強度，但對皮膚無刺激性;鳥類急性經(jīng)口LD50≥2 250 mg·kg-1，亞急性LC50≥5 620 mg·kg-1，均為低毒;對冷水魚和溫水魚，LC50＞9.2和8.8 mg·kg-1，屬于中等毒性。慢性和亞慢性試驗結果表明，氯吡脲只對鼠腎臟有輕微的影響，而對其他器官無影響，也無神經(jīng)毒性、致癌或內(nèi)分泌干擾毒性。歐盟、美國、澳大利亞和日本評估后規(guī)定氯吡脲每日允許攝入量 (ADI)值分別為 0.05，0.07，0.07 和 0.093 mg·kg-1bw［6-9］。

按照國際上普遍認可的分析評估原理和方法，用式 (1)估計每日攝入量 (EDI)，慢性攝入風險用式 (2)，估計每日攝入量占ADI的百分率表示:

當風險商＞100時，表示存在不可接受的較大風險，數(shù)值越大，風險越大;當風險商≤100時，表示風險可以接受，數(shù)值越小，風險越小。

以本次豆芽機孵化黃綠豆芽為例，豆芽體內(nèi)所含氯吡脲濃度隨著浸泡液濃度的增加而上升，浸泡溶液為1.0 mg·L-1時，綠豆芽最高殘留量為0.035 mg·kg-1，以綠豆芽黃豆芽產(chǎn)量最大的0.02 mg·L-1浸泡濃度，綠豆芽體內(nèi)含0.002 mg·kg-1，黃豆芽含0.003 mg·kg-1，約為氯吡脲濃度的10%～15%，殘留量不高。

根據(jù)表3，不同年齡階段消費人群的體重以及蔬菜消費量，同時根據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學的調(diào)查估算數(shù)據(jù)，我國成年人豆芽平均每日消費量15 g左右，兒童按成人的1/2計，按實驗室豆芽機的黃豆芽0.003 mg·kg-1殘留量為Ci，同時以最為嚴格的歐盟ADI值為考量，以食用實驗室豆芽機孵化豆芽的作為情形1，氯吡脲的風險商在各年齡段在0.0013%～0.0035%;如果假設所有年齡段人群每天消費的所有蔬菜均為實驗室豆芽機孵化的豆芽作為情形2，氯吡脲的各類人群攝入量也只有 0.014～0.030μg·kg-1，僅占 ADI值的0.027% ～0.059%，此數(shù)據(jù)與張志恒等［10］報道的氯吡脲在果蔬中的慢性膳食攝入風險相吻合。所以即使按照最大風險原則每天消費的蔬菜均為含

式中:EDI為估計每日攝入量 (μg·kg-1bw);Ci為第i種食物的平均殘留值 (mg·kg-1);Fi為第 i種食物的消費量 (g·d-1);bw為體重 (kg)。0.003 mg·kg-1殘留量進行評估，各類人群的氯吡脲攝入量也遠低于每日允許攝入量，通過實驗室豆芽機孵化出的豆芽風險可以接受 (表3)。居民實際食用豆芽的量與上述的調(diào)查數(shù)據(jù)會有出入，但考慮到上述的評估已顯示氯吡脲的膳食風險很低，因此對最終結論基本沒有影響。

表3 不同年齡階段消費人群的體重、蔬菜消費量及氯吡脲風險

3 小結與討論

豆芽生長中單獨使用氯吡脲的效果不明顯，0.02 mg·L-1的氯吡脲浸泡對產(chǎn)量的增加有作用，隨著浸泡液濃度的增加，抑制效果開始產(chǎn)生，作為一種具有細胞分裂素活性的苯脲類植物生長調(diào)節(jié)劑，其生物活性較6-芐氨基嘌呤高10～100倍，所以使用的濃度很低，從實驗效果看增產(chǎn)作用不明顯，故與其他植物生長調(diào)節(jié)劑混合使用的概率較大。以濃度為0.02 mg·L-1浸泡液為例，豆芽中殘留量僅為0.003 mg·kg-1，即使按照最大風險原則進行評估，各類人群的氯吡脲攝入量也遠低于每日允許攝入量，風險可以接受。

［1］ 朱杰麗，楊柳，柴振林，等.氯吡脲對“徐香”獼猴桃果實品質(zhì)的影響［J］.福建林業(yè)科技，2014(1):113-115，165.

［2］ 張立恒，高秀巖，潘鳳榮，等.赤霉素與氯吡脲對“早霞玫瑰”葡萄無核化及果實品質(zhì)的影響 ［J］.北方園藝，2014(14):25-27.

［3］ 宋新，丁璞，李先寬，等.氯吡脲對五味子果實形態(tài)和木脂素的影響 ［J］.中國中藥雜志，2015，39(9):1579-1583.

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.農(nóng)藥電子查詢服務系統(tǒng) ［DB/OL］.http://www.ny100.cn/.2011-09-14.

［5］ 朱杰麗，楊柳，柴振林，等.不同濃度氯吡脲對東魁楊梅果實生長及品質(zhì)影響 ［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41(12):172-174.

［6］ European Commission Health ＆ Consumer Protection Directorate-General.Review report for the active substance forchlorfenuron［R/OL］. (2005-09-23) http://ec.europa.eu/food/plant/protection/evaluation/newactive/forchlorfenuron_draft_review_report.pdf.2011-09-14.

［7］ United States Environmental Protection Agency.Pesticide fact sheet:forchlorfenuron［R/OL］.(2004-09).http://www.epa. gov/opprd001/factsheets/forchlorfenuron. pdf. 2011-09-14.

［8］ Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority.Publicrelease summary on evaluation of the new active forchlorfenuron ［R/OL］.(2005-09).http://www.apvma.gov.au/registration/assessment/docs/prs_forchlor-fenuron.pdf.2011-09-14.

［9］ 協(xié)和醗酵工業(yè)株式會社バイオケミカル事業(yè)本部.ホルクロルフェニュロンの毒性試験の概要［R/OL］.(1998-02-02)http://wwwsoc.nii.ac.jp/pssj2/journal/tec_info/forchlor.pdf.2011-09-14.

［10］ 張志恒，湯濤，徐浩，等.果蔬中氯吡脲殘留的膳食攝入風險評估［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45(10):1982-1991.