鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)分化與增殖試驗(yàn)

石麗敏，盧華兵，胡賢女

(浙江省東陽(yáng)玉米研究所，浙江東陽(yáng) 322100)

鐵皮石斛 (Dendrobium officinale)，又名黑節(jié)草，為蘭科石斛屬植物，是傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱、止咳潤(rùn)肺的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力和擴(kuò)張血管的作用。鐵皮石斛蒴果成熟時(shí)易開(kāi)裂，且種子粒徑小，自然繁殖率低。由于鐵皮石斛生長(zhǎng)條件的特殊性和分布的局限性以及多年的人為過(guò)度采挖破壞，自然資源瀕臨枯竭，成為瀕危植物，被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材品種。因此，為了保護(hù)和有效利用鐵皮石斛，采用組織培養(yǎng)技術(shù)，大量快速繁殖鐵皮石斛組培苗顯得尤為重要。以鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖，再通過(guò)原球莖的分化、增殖培養(yǎng)而得到大量幼苗，這種快繁方法可加快鐵皮石斛繁殖速度，推進(jìn)工廠化育苗。筆者以鐵皮石斛種子為外植體進(jìn)行了鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)與增殖的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試鐵皮石斛的成熟蒴果 (種齡5個(gè)月以上)采于浙江省東陽(yáng)玉米研究所塘西試驗(yàn)基地。

1.2 方法

采集鐵皮石斛成熟蒴果，經(jīng)過(guò)表面消毒處理，剖開(kāi)蒴果取出種子接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的誘導(dǎo)，種子膨大產(chǎn)生原球莖并分化成小苗，將分化形成的小苗轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基:MS+7.0 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭，pH值5.8。培養(yǎng)條件:溫度 (25±1)℃，光強(qiáng)為2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.1 外植體的消毒處理

將鐵皮石斛的蒴果先用自來(lái)水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來(lái)水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%的升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用無(wú)菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時(shí)，將經(jīng)過(guò)表面消毒的蒴果放在無(wú)菌的不銹鋼盤(pán)上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開(kāi)，取出種子，均勻地接種到培養(yǎng)基表面。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為 (25±2)℃，以日光燈為光源，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，每天照光12 h。

1.2.3 原球莖的誘導(dǎo)與分化

以MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置8個(gè)處理，分別添加不同濃度的NAA，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。將種子接種在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理接種5皿，接種后的培養(yǎng)皿先遮光培養(yǎng)10 d后，再進(jìn)行光培養(yǎng)。40 d后統(tǒng)計(jì)原球莖的誘導(dǎo)情況，90 d后調(diào)查幼苗分化情況。

1.2.4 幼苗增殖

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6個(gè)處理，分別添加不同濃度的NAA。將原球莖分化出的幼苗轉(zhuǎn)接到幼苗增殖培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種25株。90 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)幼苗增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖誘導(dǎo)與分化

接種10 d左右，種子開(kāi)始萌發(fā)變綠，40 d左右可明顯看到膨大的原球莖，且部分原球莖開(kāi)始分化出芽尖。90 d左右可明顯看到分化出的小苗。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同處理上種子均可萌發(fā)誘導(dǎo)出原球莖，可知在培養(yǎng)基中不添加或者添加低濃度的NAA可促進(jìn)種子的萌發(fā)。

由表1可以看出，以MS為基本培養(yǎng)基的處理原球莖誘導(dǎo)率均高于以1/2MS為基本培養(yǎng)基的處理。在激素配比試驗(yàn)中可看出，處理1，2的原球莖誘導(dǎo)率最高為100%，處理8的誘導(dǎo)率最低為20%。

表1 不同激素配比對(duì)原球莖誘導(dǎo)及分化的影響

處理2的幼苗分化率最高為99%，處理1，6次之，為90%。處理4，8的幼苗分化率最低，為5%。由此可以看出，高濃度NAA抑制幼苗分化，低濃度NAA促進(jìn)幼苗分化。

綜合原球莖誘導(dǎo)和分化情況可知，MS中添加0.1 mg·L-1NAA可有效促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)和發(fā)育。

2.2 幼苗增殖

由表2可以看出，不同處理培養(yǎng)基上幼苗均能增殖，增殖系數(shù)隨著NAA濃度增加而變大，處理4當(dāng)NAA濃度為0.22 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)最大，為3.8;隨著NAA濃度進(jìn)一步增加，增殖系數(shù)逐漸變小。處理3幼苗生長(zhǎng)較整齊，苗較高，根系比較旺盛;處理4幼苗短小而粗壯，苗勢(shì)較好。綜合幼苗增殖和生長(zhǎng)情況可知，MS中添加0.15～0.20 mg·L-1NAA可有效促進(jìn)鐵皮石斛幼苗增殖和生長(zhǎng)。

表2 不同NAA濃度對(duì)幼苗增殖的影響

3 小結(jié)與討論

通過(guò)接種成熟種子對(duì)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選發(fā)現(xiàn)，在MS+0.1 mg·L-1NAA+7.0 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭上，鐵皮石斛成熟種子能順利萌發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，并自然分化形成幼苗。在MS+0.15～0.2 mg·L-1NAA+7.0 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭上，幼苗能快速進(jìn)行增殖，并長(zhǎng)出少量不定根。

組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有多種，關(guān)于利用成熟種子進(jìn)行快繁，文獻(xiàn)報(bào)道較多的是用成熟的種子消毒后進(jìn)行無(wú)菌播種形成原球莖，并經(jīng)過(guò)增殖、分化發(fā)育成完整植株［1］。本研究中種子消毒后無(wú)菌播種誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，并直接分化出幼苗，再通過(guò)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基促進(jìn)小苗增殖，再進(jìn)行生根壯苗進(jìn)而達(dá)到快繁的目的。其他報(bào)道中的原球莖誘導(dǎo)、增殖再分化的過(guò)程需要3種不同的培養(yǎng)基，而本研究中，原球莖誘導(dǎo)、分化再增殖都在同一種培養(yǎng)基上，僅需再轉(zhuǎn)接進(jìn)行增殖，從而減少轉(zhuǎn)接過(guò)程，在工廠化育種中大大減少了工作量，降低了成本。

［1］ 楊柳平，劉暢慶，趙仁發(fā)，等.鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖組培快繁體系的研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(7):54-57.