端粒酶催化亞單位基因誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

劉新生，許予明

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs 在神經(jīng)系統(tǒng)研究中有著廣泛的應(yīng)用，治療腦血管疾病、老年性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效途徑之一就是進(jìn)行干細(xì)胞移植。然而，MSCs 的生命周期是有限的，在體外培養(yǎng)20 代后即開始衰老，這一缺陷限制MSCs 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。建立正常的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系是實(shí)現(xiàn)應(yīng)用的前提。本研究將外源性hTERT 轉(zhuǎn)染至人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建立永生化的細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pCDNA3.1-hTERT 重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建，轉(zhuǎn)染試劑Fugene 6(Roche 公司)，淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD 公司)。鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD34 及SV40 單克隆抗體工作液(Santa Cruz 公司)。

1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的提取、培養(yǎng)及鑒定 無菌采集捐獻(xiàn)者的骨髓3 ml，肝素抗凝，與磷酸鹽緩沖液(PBS)等體積混勻，沿液面小心滴加到淋巴細(xì)胞分離液上(1∶1)，離心。離心后骨髓分4 層，小心吸取薄膜層，再次離心，洗滌。在光學(xué)顯微鏡下記數(shù)，常規(guī)培養(yǎng)。3 d 后換液，9～11 d 進(jìn)行首次傳代，后平均7～8 d 傳代一次，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。應(yīng)用細(xì)胞表面抗原CD44、CD45、CD29、CD34 對第3 代hMSCs 進(jìn)行鑒定。

1.3 hMSCs 的轉(zhuǎn)染及篩選 取第3 代對數(shù)生長期的hMSCs，以每空5×105的密度接種到六孔培養(yǎng)板。在無菌Eppendorf 管中按每孔細(xì)胞量制備下列溶液:溶液:各7 μg 質(zhì)粒溶于300 μl 無血清培養(yǎng)基中。將混合液沿壁小心滴加到80%融合的hMSC上，常規(guī)培養(yǎng)6 h。48 h 后加新霉素G418 篩選，終濃度為400 μg/ml。第4 天，對照組細(xì)胞大部分死亡。利用濾紙片法和有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)染的傳代細(xì)胞鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)、生長特性，選擇有代表性的生長特點(diǎn)攝像。

1.4.2 細(xì)胞免疫組化法 取第3 代未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及第3 代和34 代轉(zhuǎn)染后hMSCs，爬片，固定，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，正常山羊血清封閉，滴加一抗工作液(鼠抗人CD44、CD45、CD29、CD34 及SV40單克隆抗體)，4 ℃過夜，滴加生物素化二抗工作液，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB 避光顯色、脫水、封片。陰性對照用0.01 mol/L 的PBS 代替一抗。

1.4.3 PCR 擴(kuò)增 提取培養(yǎng)細(xì)胞的基因組DNA，以轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做陰性對照，重組質(zhì)粒做陽性對照。根據(jù)hTERT 基因序列設(shè)計(jì)引物，上游:5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’，下游:5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’。產(chǎn)物為145 bp 片段。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃60 s，33 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.5 細(xì)胞系的保存 取生長良好、不同代的轉(zhuǎn)染后MSCs，消化、終止、離心，凍存液重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×109/L，加入凍存管，逐級降溫，液氮保存。

2 結(jié)果

2.1 接種后的24～48 h，體積較大的單個(gè)核細(xì)胞逐漸貼壁，72 h 后貼壁細(xì)胞開始分裂增殖，細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞梭形外觀。1 w 后，造血細(xì)胞基本消失，貼壁細(xì)胞體積增大，仍呈梭形，有粗大突起伸出，有些細(xì)胞則呈三角形或多角形。2 w 后，細(xì)胞融合成單層，梭形突起變長，排列有明顯方向性，細(xì)胞排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀。免疫細(xì)胞化學(xué)染色后顯示所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜CD29、CD44 有陽性表達(dá)，CD34、CD45 呈陰性表達(dá)。

2.2 轉(zhuǎn)染和篩選后獲得一陽性細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得形態(tài)學(xué)特征單一、穩(wěn)定的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后的hMSCs 形態(tài)變小，仍以梭形為主，部分呈三角形或多角形，增殖快，平均3～5 d 傳代一次。目前已傳至40 余代(見圖1)。

2.3 細(xì)胞免疫組化法結(jié)果顯示:第3 代未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及第4 代和35 代轉(zhuǎn)染后MSCs 細(xì)胞膜CD29、CD44 有陽性表達(dá)，CD34、CD45 呈陰性表達(dá)，與原代細(xì)胞保持一致。同時(shí)也檢測到第4 代和35 代轉(zhuǎn)染后MSCs 胞內(nèi)有大量橙色顆粒，hTERT 表達(dá)呈陽性反應(yīng)(見圖2)，表明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

2.4 實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組擴(kuò)增出hTERT 特異條帶(見圖3)，而陰性對照組則沒有，表明hTERT基因已穩(wěn)定整合入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組中。

圖1 生長旺盛的第37 代轉(zhuǎn)染后細(xì)胞(×100)

圖2 第35 代轉(zhuǎn)染后hMSCs-hTERT 表達(dá)呈陽性

圖3 實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組擴(kuò)增出hTERT 特異條帶

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一群來源于骨髓組織中的非造血細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，已證實(shí)這類細(xì)胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細(xì)胞分化［1～4］，是組織工程中重要的種子細(xì)胞。目前MSCs 移植中所用的細(xì)胞主要是未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs，如Brazelton等［5］觀察到在體內(nèi)條件下，外源性MSCs 在小鼠的體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞(表達(dá)NeuN、NF 等神經(jīng)元標(biāo)志蛋白)。但是Dezawa 等［6］發(fā)現(xiàn)將在體外誘導(dǎo)為Schwann 細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)的MSCs 移入截?cái)嗟淖巧窠?jīng)末端，與移植未誘導(dǎo)的MSCs 相比，使坐骨神經(jīng)再生更顯著，是否誘導(dǎo)后的MSCs 更有助于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的恢復(fù)值得進(jìn)一步研究。端粒是位于真核染色體末端的具有特殊功能的DNA 帽狀結(jié)構(gòu)，由不含功能基因的簡單重復(fù)的非編碼序列和相關(guān)蛋白組成，在進(jìn)化中高度保守。端粒在穩(wěn)定染色體及防止染色體末端融合等方面具有重要的作用［7］。端粒酶是一種由RNA 和蛋白質(zhì)組成的核糖核酸蛋白酶，具有逆轉(zhuǎn)錄活性，不依賴DNA 聚合酶，可以與自身攜帶的RNA 模板合成端粒重復(fù)序列。端粒酶由450 bp 的RNA 和至少2 個(gè)蛋白亞單位組成，其RNA 是無意義的核酸序列，不編碼蛋白質(zhì)。端粒酶的活性可以通過調(diào)控端粒酶的RNA 成分或(和)蛋白質(zhì)成分來實(shí)現(xiàn)。迄今已有2 個(gè)蛋白亞單位被克隆:端粒酶相關(guān)蛋白1(TEP1)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。這兩種蛋白組分可對端粒酶活性起到調(diào)節(jié)作用［8］，尤其是其催化亞單位hTERT(human telomerase reverse transcriptase)，人類端粒酶催化亞單位的活性中心具有與逆轉(zhuǎn)錄酶相似的結(jié)構(gòu)和功能，作用尤為重要［9］。有研究表明，hTERT 僅存在于端粒酶陽性表達(dá)的細(xì)胞中，在缺乏端粒酶活性的正常細(xì)胞中無表達(dá)［10，11］，提示hTERT 是調(diào)節(jié)端粒酶活性的正調(diào)控因子，其表達(dá)是端粒酶活性的決定因素和限速步驟。將hTERT 基因?qū)氩槐磉_(dá)人端粒酶RNA 和無端粒酶活性的正常體細(xì)胞可以有效重建這些細(xì)胞中的端粒酶活性。己報(bào)道的通過導(dǎo)入hTERT 基因成功獲得永生化的人類細(xì)胞有視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、胎盤細(xì)胞、牙組織細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、包皮成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和胰腺nestin 陽性細(xì)胞等。這些永生化細(xì)胞獲得了適應(yīng)體外生長的條件，且沒有發(fā)生表型改變，也沒有致瘤性，其生長、分化等多種生物學(xué)特性并未受到影響［12］。

本實(shí)驗(yàn)通過外源性hTERT 基因在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的異位表達(dá)，誘導(dǎo)MSCs 的端粒酶活性，維持細(xì)胞染色體核型的穩(wěn)定，從而使人骨髓MSCs 的壽命明顯延長，建立了較穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)而對其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。該細(xì)胞系具備了原代細(xì)胞的典型形態(tài)特征以及某些生物學(xué)功能，可以成為神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞移植研究中的理想細(xì)胞材料，為其在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究做前期準(zhǔn)備。

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