2ME2 對脊髓損傷大鼠運動功能及凋亡相關(guān)基因caspase-3 表達(dá)的影響

張鴻日，徐如祥，彭靜華，程小兵

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是臨床常見疾病，目前治療脊髓損傷最常用方法有手術(shù)治療、干細(xì)胞移植、藥物治療等。在藥物治療中，激素沖擊療法已廣泛應(yīng)用于急性脊髓損傷早期，但可以出現(xiàn)消化道出血、股骨頭壞死、代謝紊亂等并發(fā)癥。2-甲氧基雌二醇(2ME2)是雌激素的正常代謝產(chǎn)物，存在于人體的血液與尿液中，有報道在全腦缺血大鼠模型、局灶性腦缺血模型、蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型及顱腦損傷大鼠模型中，2ME2 均可以通過抑制神經(jīng)凋亡起到神經(jīng)保護作用［1～3］，但對脊髓損傷后的作用目前國內(nèi)外研究較少。

本實驗旨在探討2-甲氧基雌二醇(2ME2)對脊髓損傷(SCI)大鼠運動功能及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3 表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動物和分組 健康成年雄性Sprague-Dawley 大鼠72 只，由北京維通利華公司提供，體重(305±20)g，隨機分為假手術(shù)組(n=24)、脊髓損傷組(n=24)和2ME2 治療組(n=24)3 組。

1.2 脊髓損傷大鼠模型制作及組織獲取 采用改良的Allen’s 法制作脊髓損傷大鼠模型［4］。用3%水合氯醛腹腔麻醉，取背部正中長約3 cm 切口，顯露C9-C11 棘突及椎板。咬除棘突及椎板，顯露脊髓6 mm。用10 g 打擊棒，高度12.5 cm 實施打擊脊髓。撞擊成功標(biāo)準(zhǔn):擊打部位脊髓組織出血，腫脹，大鼠出現(xiàn)擺尾及雙下肢撲動數(shù)秒，雙后肢癱瘓，麻醉蘇醒后出現(xiàn)后肢癱瘓，尿潴留。每日給予大鼠擠尿2～3 次。每組在相應(yīng)時間點取樣進行免疫熒光及TUNEL 染色。腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剪開胸腔，從心尖插入灌注針頭，剪開右心耳，灌注加入肝素鈉的生理鹽水直到肝臟變白，右心耳流出澄清液，再灌注4% 多聚甲醛PBS 溶液1 h。打開椎弓板暴露胸段脊髓取材，置入4%多聚甲醛中4 ℃冰箱固定24 h。

1.3 干預(yù)劑的應(yīng)用 脊髓損傷大鼠模型建立后第1 天開始，2ME2 治療組大鼠按24 mg/kg 給予2ME2(美國sigma 公司)腹腔注射，連續(xù)注射7 d。脊髓損傷組大鼠給予等劑量生理鹽水腹腔注射，假手術(shù)組不給予干預(yù)措施。

1.4 應(yīng)用BBB 評分系統(tǒng)對大鼠運動功能進行評估 應(yīng)用Basso、Beatti、Bresnahan(BBB)評分法對損傷后動物后肢功能進行評分。每組取8 只大鼠，將大鼠置于7 cm 高、直徑90 cm 的平坦不滑的塑膠模板上，于模型制作后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d進行評估。

1.5 應(yīng)用免疫熒光染色檢測caspase-3 表達(dá)模型建立后第7 天各組取8 只大鼠進行脊髓取材，并制作冰凍切片。加入3%TritonX-100 破細(xì)胞膜，室溫孵育30 min，加入10%小牛血清封閉1 h，加入兔抗鼠caspase-3 一抗(abcam Invitrogen 公司，1∶200)4 ℃孵育過夜，次日加入熒光標(biāo)記的驢抗兔二抗(abcam Invitrogen 公司，1∶1000)。將切片置于熒光顯微鏡下觀察，顯微鏡下每張切片隨機選取10個視野觀察陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 凋亡細(xì)胞檢測 模型建立后第7 天各組取8 只大鼠進行脊髓取材，按照TUNEL 試劑盒說明書操作(sigma 公司)，顯微鏡下切片進行陽性細(xì)胞計數(shù)。鏡下每張切片隨機選取10 個高倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷大鼠模型制作 損傷成功的標(biāo)志:擊打部位脊髓組織出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動，雙后肢呈遲緩性癱瘓，麻醉蘇醒后出現(xiàn)后肢不能自主活動，肌張力低，明顯尿潴留。

2.2 BBB 評分 脊髓損傷組和2ME2 治療組脊髓損傷后隨著時間延長BBB 評分升高，評分明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，損傷后1 d、3 d、7 d 脊髓損傷組和脊髓損傷2ME2 干預(yù)組相比BBB 評分均有升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，14 d、21 d、28 d 2ME2 治療組評分明顯高于脊髓損傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表1)。

2.3 免疫熒光檢測caspase-3 表達(dá) 與假手術(shù)組(4.583±2.234)比較，脊髓損傷組(33.417±4.274)及2ME2 治療組(22.250±4.048)免疫熒光染色caspase-3 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，2ME2 治療組caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)較脊髓損傷組顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見圖1)。

2.4 TUNEL 染色 與假手術(shù)組(12.25±2.67)相比，脊髓損傷組(49.17±4.75)及脊髓損傷2ME2 治療組(38.67±4.44)凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，2ME2 治療組凋亡細(xì)胞指數(shù)較脊髓損傷組顯著減低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 假手術(shù)組、脊髓損傷和2ME2 治療組脊髓損傷后不同時間BBB 評分(±s，n=8)

表1 假手術(shù)組、脊髓損傷和2ME2 治療組脊髓損傷后不同時間BBB 評分(±s，n=8)

F 組別=6498.993 P＜0.05;F 時間=614.913 P＜0.05;F 交叉=232.146 P＜0.05

圖1 各組caspase-3 蛋白免疫熒光染色(個/高倍視野，×400)

3 討論

脊髓損傷是常見疾病，給患者及家庭帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。目前脊髓損傷機制及治療仍是醫(yī)學(xué)研究的熱點。目前，激素沖擊療法是目前脊髓損傷早期治療的一種常用手段之一，激素在脊髓損傷的治療中通過改善微循環(huán)、清除氧自由基、抗氧化作用等抑制脊髓損傷早期神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而減輕脊髓繼發(fā)性損傷，促進脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。但激素的應(yīng)用有可能出現(xiàn)較嚴(yán)重的副作用。

2-甲氧基雌二醇(2ME2)是雌激素的正常代謝產(chǎn)物，存在于人體的血液與尿液中，目前研究表明2ME2 在一些病理性神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程中具有一定的神經(jīng)保護作用。Wu C［1］等報道HIF-1α 通過上調(diào)其下游靶基因BNIP3、VEGF 表達(dá)，在蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的早期腦損傷，包括細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞、腦水腫過程中，扮演重要角色，2ME2 抑制HIF-1α 表達(dá)，從而降低了上述損傷。Chen C［2］等研究表明2ME2 在局灶性腦缺血大鼠模型中具有明顯的神經(jīng)保護作用，其機制是通過抑制HIF-1α 表達(dá)，從而減少VEGF 的過度表達(dá)所引起的血腦屏障破壞，和抑制BNIP3 通路神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Li Y［3］等報道在全腦缺血大鼠模型中2ME2 通過抑制HIF-1α 表達(dá)，上調(diào)survivin 表達(dá)，抑制caspase-3，具有抗凋亡作用。Yan J［5］等研究發(fā)現(xiàn)2ME2 通過抑制HIF-1A 及下游靶基因VEGF 表達(dá)，抑制內(nèi)皮生長，抑制BNIP3 通路的凋亡，減少血管增生，從而減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h 大鼠腦血管痙攣。Wang YF［6］等報道2ME2 可以通過抑制HIF-1α 表達(dá)，從而經(jīng)依賴于VEGF 通路和非依賴于VEGF 通路抑制aquaporin-4(AQP4)和aquaporin-1(AQP1)的表達(dá)，從而減輕脊髓損傷后的水腫，具有神經(jīng)保護作用。這與我們的結(jié)論相符。

本研究發(fā)現(xiàn)，2ME2 改善脊髓損傷大鼠模型脊髓損后的運動功能，具有神經(jīng)保護作用，其可能通過降低脊髓損傷后caspase-3 蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。但2ME2 的神經(jīng)保護機制尚不明確，仍需進一步研究探討。

［1］Wu C，Hu Q，Chen J，et al.Inhibiting HIF-1α by 2ME2 ameliorates early brain injury after experimental subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，437(3):469-474.

［2］Chen C，Hu Q，Yan J，et al.Multiple effects of 2ME2 and D609 on the cortical expression of HIF-1alpha and apoptotic genes in a middle cerebral artery occlusion-induced focal ischemia rat model［J］.J Neurochem，2007，102(6):1831-1841.

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［4］Young W.Spinal cord contusion models［J］.Prog Brain Res，2002，137:231-255.

［5］Yan J，Chen C，Lei J，et al.2-methoxyestradiol reduces cerebral vasospasm after 48 hours of experimental subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Exp Neurol，2006，202(2):348-356.

［6］Wang YF，F(xiàn)an ZK，Cao Y，et al.2-Methoxyestradiol inhibits the upregulation of AQP4 and AQP1 expression after spinal cord injury［J］.Brain Res，2011，25(1370):220-226.