SOD1-G93A 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)SIRT1 的變化及白藜蘆醇對(duì)其的影響

于莎莎，吳紅然，李園園，杜 娟，宋學(xué)琴

ALS(肌萎縮側(cè)索硬化)是累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，臨床上常表現(xiàn)為肌無(wú)力、肌萎縮，而感覺和括約肌的功能一般不會(huì)受到影響。目前對(duì)于ALS 的病因及發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，近年來(lái)研究提出一些假說(shuō)，如遺傳機(jī)制、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體功能障礙、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子障礙、自身免疫機(jī)制、病毒感染及環(huán)境因素等，至今病因未明。而無(wú)論是哪種病因假說(shuō)，其最終結(jié)果都是導(dǎo)致細(xì)胞壽命的縮短，使神經(jīng)細(xì)胞提早死亡。延長(zhǎng)神經(jīng)細(xì)胞的壽命成為神經(jīng)變性疾病研究的熱點(diǎn)，長(zhǎng)壽蛋白(SIRT1)是釀酒酵母菌SIR2(SIR2 基因編碼的蛋白是NAD+依賴的去乙?；?，參與延長(zhǎng)酵母菌壽命)基因同源的NAD+依賴的一組酶。SIRT1 能夠延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是多酚類化合物，它主要來(lái)源于蓼科植物的根莖中，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗心血管疾病等作用，已被證實(shí)可以激活SIRT1 并且廣泛用于各種實(shí)驗(yàn)中，是近來(lái)研究較多的SIRT1 的激動(dòng)劑，Res 可以激活SIRT1，在神經(jīng)退行病等疾病中具有保護(hù)作用。SIRT1 與白藜蘆醇在ALS 中的研究還未見廣泛報(bào)道，本文利用SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型，檢測(cè)隨著疾病進(jìn)展，SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及腰髓中SIRT1 的動(dòng)態(tài)變化，以及白藜蘆醇對(duì)SIRT1 的影響，探討白藜蘆醇對(duì)ALS 的干預(yù)程度。

1 材料和方法

1.1 分組 選取表達(dá)人突變基因SOD1 的SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠及其野生型小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及處理組，對(duì)照組選取90 d 野生型小鼠。實(shí)驗(yàn)組則選取經(jīng)PCR 鑒定結(jié)果為SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因的小鼠。根據(jù)其時(shí)間點(diǎn)分為3 組:(1)癥狀前期組;(2)癥狀早期組;(3)終末期組。處理組選取經(jīng)PCR鑒定結(jié)果為SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因的70 d 的小鼠，根據(jù)給予3 種不同的處理方式，分為白藜蘆醇組(Sigma，101237259，30 mg/kg/d)、溶劑組(同等體積乙醇生理鹽水溶液)、空白組(未予任何處理)，根據(jù)處理時(shí)間不同每種處理方式又分為2 個(gè)亞組，處理時(shí)間為20～30 d、50～60 d。共6 組，每組6 只小鼠，3 只用于蛋白定量，3只用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2 Western blot 技術(shù) 檢測(cè)不同時(shí)期SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及腰髓中SIRT1 水平及給予白藜蘆醇后SIRT1 蛋白的表達(dá)情況。

1.3 免疫組織化學(xué)方法 觀察不同時(shí)期SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及腰髓前角細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)和給予白藜蘆醇后SIRT1 免疫活性的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析。P＜0.05 即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P=0.05)。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 結(jié)果 隨著ALS 疾病的進(jìn)展，SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 的表達(dá)量增加;與對(duì)照組相比，60 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及腰髓中SIRT1 表達(dá)量無(wú)明顯變化，癥狀早期及終末期SIRT1 表達(dá)量增多，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。癥狀早期組與終末期相比SIRT1 表達(dá)量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見圖1、表1)。在癥狀早期SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中，溶劑組SIRT1 表達(dá)量最高，白藜蘆醇組居中，空白組最低，白藜蘆醇組較溶劑組SIRT1 表達(dá)量減少，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，白藜蘆醇組SIRT1 表達(dá)量較空白組有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，溶劑組較空白組SIRT1 表達(dá)量增加，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2、表2)。在終末期SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中，白藜蘆醇組、溶劑組SIRT1 表達(dá)量均較空白組有增高趨勢(shì)，但各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(見圖3、表3)。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 隨著ALS 疾病的進(jìn)展，小鼠腰髓與運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中，60 d 組SIRT1 表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯差別，癥狀早期及終末期SIRT1 表達(dá)較對(duì)照組增加(見圖4)。癥狀早期SOD1-G93A 小鼠腰髓與運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)中，白藜蘆醇組SIRT1 較溶劑組表達(dá)減少，白藜蘆醇組較空白組表達(dá)增高，但無(wú)明顯差別;溶劑組較空白組SIRT1 表達(dá)增多;終末期白藜蘆醇組SIRT1 表達(dá)較溶劑組減少，較空白組增加，溶劑組較空白組增加(見圖5)。

表1 各期SIRT1 的比較

表2 不同處理至發(fā)病早期SIRT1 的比較

表3 不同處理至終末期SIRT1 的比較

圖1 Western blot 示SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中不同時(shí)期SIRT1 表達(dá)量

圖2 Western blot 給予3 種不同處理方式至癥狀早期時(shí)SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)量

圖3 Western blot 給予3 種不同處理方式至終末期時(shí)SOD1-G93A小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)量

3 討論

ALS 是一種成人發(fā)病的進(jìn)行性、致死性的神經(jīng)退行性疾病，以大腦與脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性丟失為特征，家族性ALS 約占運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的5%～10%，其中約20%與銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)遺傳突變有關(guān)，人們發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)人類突變SOD1 基因的小鼠，具有與人類ALS 患者相似的表現(xiàn)，有助于我們理解研究人類ALS。sirtuins 是一類與釀酒酵母菌沉默調(diào)節(jié)因子2(SIR2)基因高度同源的NAD+依賴的、進(jìn)化過(guò)程非常保守的去乙?；割?。它參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，如調(diào)節(jié)代謝、進(jìn)行染色體維護(hù)、延長(zhǎng)壽命等。哺乳動(dòng)物SIR2 基因同源蛋白為SIRT1，與SIR2 具有相同的酶活性，可以對(duì)多種蛋白去乙酰化，包括核蛋白與胞漿蛋白。SIRT1 加強(qiáng)了細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制及給予其時(shí)間來(lái)維持細(xì)胞功能，這與神經(jīng)退行性疾病具有高度相關(guān)性，在神經(jīng)元丟失中起重要作用，特別是在大腦這類神經(jīng)不可再生的組織中［1］。

SIRT1 與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。有學(xué)者研究在PD 中，SIRT1 表達(dá)量增多能減少M(fèi)PP+所致中腦多巴胺神經(jīng)元的丟失［2］，在AD 中，變性神經(jīng)元中β 淀粉樣蛋白沉積與神經(jīng)元間的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD 的主要病理特征，SIRT1 可以去乙?；{(diào)節(jié)NFκB，減少Aβ 蛋白生成，來(lái)起到神經(jīng)保護(hù)的作用［3］。在亨廷頓氏舞蹈癥中亦有重要保護(hù)作用，亨廷頓患者基因突變導(dǎo)致了紋狀體區(qū)錯(cuò)誤翻譯蛋白(稱為亨廷頓蛋白)的異常聚集，這些錯(cuò)誤翻譯折疊的蛋白聚集成塊狀物沉積在紋狀體神經(jīng)元中，造成神經(jīng)元的死亡，SIRT1 可以調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄沉默，通過(guò)對(duì)一系列相關(guān)蛋白去乙?；?，修復(fù)染色體及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)［4，5］，在ALS 以及AD 的小鼠模型中，也有人證實(shí)，SIRT1 阻止了神經(jīng)元的變性［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在癥狀早期及終末期G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)均明顯增多，說(shuō)明SIRT1 隨著神經(jīng)元的退行過(guò)程其表達(dá)是增加的，而終末期腰髓組織中神經(jīng)元數(shù)目減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，有關(guān)文章指出在細(xì)胞受氧化應(yīng)激等損傷時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中SIRT1 的表達(dá)就會(huì)增加，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞不受損害，而本實(shí)驗(yàn)ALS 小鼠模型中，終末期腰髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中氧化應(yīng)激導(dǎo)致嚴(yán)重細(xì)胞受損，星形膠質(zhì)細(xì)胞中SIRT1 表達(dá)增加，所以終末期總體SIRT1 表達(dá)增多［7］。這與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相符，癥狀早期G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)增高，終末期也增高，說(shuō)明SIRT1 保護(hù)性作用是隨著疾病發(fā)展增加的。這些都支持SIRT1 是與ALS 中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失是相關(guān)的，并且SIRT1 可能在ALS 中起到了多種保護(hù)作用，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

白藜蘆醇是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可以激活SIRT1 的多酚類化合物，它存在于紅酒與葡萄中，白藜蘆醇具有抗氧化及抗炎的功效。它可以直接或間接地激活SIRT1，這點(diǎn)在體內(nèi)及體外模型中都曾被證實(shí)過(guò)［8］。在朊蛋白病的細(xì)胞模型中，激活SIRT1 可以起到保護(hù)細(xì)胞的作用，而這一作用正是通過(guò)給予白藜蘆醇來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并且是通過(guò)SIRT1 激活自噬(Autophagy)來(lái)減少細(xì)胞凋亡，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用。并且SIRT1 可誘導(dǎo)自噬-溶酶體途徑［9］。PD 中，白藜蘆醇可以激活SIRT1-PGC-1α 途徑阻止線粒體受氧化應(yīng)激損傷，減少中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的退化［10］，在1 甲基4 苯基吡啶(MPP+)導(dǎo)致的PD 模型中，白藜蘆醇通過(guò)SIRT1/AMPK/Autophagy 途徑來(lái)保護(hù)線粒體進(jìn)而維持神經(jīng)元生理功能［11］，以上支持SIRT1 具有神經(jīng)保護(hù)作用，白藜蘆醇作為其激活劑增強(qiáng)其作用。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與許多之前的結(jié)果有所不同，Western blot 結(jié)果示癥狀早期當(dāng)給予藥物白藜蘆醇后，G93A轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)量相對(duì)于空白組并無(wú)明顯變化，較溶劑組減少，而給予溶劑組較空白組SIRT1 表達(dá)量較白藜蘆醇組及空白組明顯增加，免疫組織化學(xué)示癥狀早期給予白藜蘆醇后，G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)較溶劑組降低，較空白組稍高，這結(jié)果表明乙醇可以使G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 的表達(dá)量增多，白藜蘆醇不僅沒有使SIRT1 表達(dá)量增多，甚至使SIRT1 的表達(dá)量降低了，難道乙醇對(duì)SIRT1 有激活作用?有實(shí)驗(yàn)者報(bào)道在慢性酒精喂養(yǎng)的酒精肝病的小鼠模型中，胃內(nèi)灌注給予乙醇后，導(dǎo)致SIRT1的表達(dá)升高，并且其靶蛋白PGC-1α 的表達(dá)也被上調(diào)，結(jié)果說(shuō)明乙醇可以使SIRT1 表達(dá)量增多，但其機(jī)制未明確闡明，同時(shí)給予白藜蘆醇卻導(dǎo)致SIRT1 表達(dá)量不再上升，并且白藜蘆醇無(wú)對(duì)抗乙醇導(dǎo)致的肝臟細(xì)胞的壞死與纖維化的功效，說(shuō)明白藜蘆醇沒有起到激活SIRT1 及保護(hù)肝臟細(xì)胞的有益作用，然而，在非酒精性脂肪肝的模型中，給予白藜蘆醇可以減少脂肪沉積，使AMPK 磷酸化增加，并且腹型肥胖和胰島素抵抗被顯著改善［12，13］，這說(shuō)明在某些疾病模型中，乙醇可以激活SIRT1，并且白藜蘆醇與乙醇合用并不會(huì)激活SIRT1，甚至?xí)档蚐IRT1，這說(shuō)明白藜蘆醇與乙醇可能會(huì)相互影響，但具體機(jī)制還需繼續(xù)深入探討。此外在肝癌細(xì)胞與初級(jí)人肝細(xì)胞中，白藜蘆醇調(diào)節(jié)SIRT1 的方式是不同的，在正常的肝細(xì)胞中，白藜蘆醇可以激活尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT，可以調(diào)節(jié)SIRT1 活性)和SIRT1，但是在肝癌細(xì)胞中，白藜蘆醇不能夠激活NAMPT 和SIRT1，而這時(shí)白藜蘆醇產(chǎn)生的是抑制SIRT1 的效應(yīng)，這與在正常肝細(xì)胞中白藜蘆醇對(duì)SIRT1 的調(diào)節(jié)是相反的，此時(shí)白藜蘆醇不再作為SIRT1 的激活劑，推測(cè)在此細(xì)胞模型中，SIRT1 不再僅僅依賴NAD+的調(diào)節(jié)，而是受到各種蛋白的共同調(diào)節(jié)。有小部分學(xué)者認(rèn)為白藜蘆醇激活SIRT1 的機(jī)制還是備受爭(zhēng)議，但機(jī)制還尚未研究透徹。

同樣在SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠中，給予小鼠白藜蘆醇后，并未起到相應(yīng)的保護(hù)神經(jīng)的作用，說(shuō)明在體內(nèi)模型中，白藜蘆醇的作用機(jī)制更加復(fù)雜，可能不是通過(guò)一條通路影響細(xì)胞功能，是通過(guò)多個(gè)信號(hào)途徑，影響多個(gè)相關(guān)蛋白的活性及表達(dá)，最終對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的是一個(gè)綜合效應(yīng)，其具體機(jī)制值得繼續(xù)深入研究。在ALS 的動(dòng)物模型中，推測(cè)可能存在與肝細(xì)胞中類似的分子機(jī)制，使得白藜蘆醇未對(duì)SIRT1 起到應(yīng)有的激活作用，反而起到抑制作用，所以隨著疾病的發(fā)展，SIRT1 在ALS 小鼠中運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中的表達(dá)增加，保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，然而對(duì)于白藜蘆醇對(duì)SIRT1 的作用機(jī)制和白藜蘆醇對(duì)ALS 有無(wú)治療效果，還需做進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)隨著ALS 疾病的進(jìn)展，SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及腰髓中SIRT1 含量逐漸增加，推斷隨著疾病的發(fā)展，各種原因?qū)е律窠?jīng)元細(xì)胞數(shù)目的減少與功能的退化，SIRT1 表達(dá)量逐漸增加，起到一定的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用，使SIRT1 成為ALS 新的治療靶點(diǎn)的可能;給予白藜蘆醇后的SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)及腰髓中，均無(wú)明顯上調(diào)SIRT1 的效應(yīng)，而單純給予溶劑的SOD1-G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠其運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓SIRT1 表達(dá)上調(diào)，白藜蘆醇沒有起到預(yù)期的保護(hù)作用，說(shuō)明白藜蘆醇可能未起到激活SIRT1 的作用甚至下調(diào)了SIRT1的表達(dá)，對(duì)今后對(duì)ALS 的研究有一定的參考意義。

圖4 免疫組織化學(xué)示疾病不同時(shí)期SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)

圖5 免疫組織化學(xué)示給予3 種不同處理至不同時(shí)期SOD1-G93A 小鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)與腰髓中SIRT1 表達(dá)

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