G-CSF 對大鼠腦出血周邊組織bcl-2、caspase-3 表達的影響

關(guān)雪蓮，侯麗淳，楊 慧，胡 婧，王 辰 王秀萍，畢 勝，許曉燕，王昆祥，和 梅

腦出血是神經(jīng)科常見病，致殘率和病死率較高。有實驗表明，細胞凋亡參與腦出血的病理發(fā)展過程［1］。bcl-2、caspase-3 是細胞凋亡傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控基因。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)具有對局灶性腦缺血大鼠模型的神經(jīng)保護機制［2～4］。本研究主要探討G-CSF 對大鼠腦出血周邊組織bcl-2、caspase-3 表達的影響，從而為G-CSF 對腦出血的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar 大鼠112 只，雌雄不限，體重200～250(221±7.7)g，由佳木斯大學實驗動物中心提供，動物隨機分為腦出血組、腦出血+G-CSF 干預(yù)組各56 只，分別分為出血前(假手術(shù)組)、出血后4 h、6 h、12 h、24 h、72 h、7 d 共7 個亞組，每組各8 只。

1.2 實驗藥品及試劑 G-CSF(山東齊魯制藥有限公司)，caspase-3 免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，bcl-2 免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。其他試劑為實驗室常用分析純試劑。

1.3 動物模型的制備 參照牛國忠［5］報導(dǎo)的方法及Deinsberger W 等［6］的方法改進，采用立體定向自體血腦內(nèi)注入法，按照包新民的《大鼠腦立體定位圖譜》［7］進行定位。Wistar 大鼠均經(jīng)過10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，俯臥固定于立體定位儀上，頭頂部剃毛消毒后正中矢狀切開，切口約1.5 cm，鈍性分離出前囟，在前囟后1 mm，右旁4 mm處用牙科鉆鉆一直徑約1 mm 小孔。腦出血組大鼠，距鼠尾末端約2 cm 處剪斷，取尾血50 μl，將微量注射器推進至已鉆孔內(nèi)，進針5.5 mm(相當于尾狀核部)先注入10 μl，停針2 min 后以10 μl/min的速度注入剩余40 μl 血液。2 min 后退針1.5 mm后停留7 min 再緩慢將針完全退出。之后縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。腦出血前組只進針不注血。腦出血加G-CSF 干預(yù)組與腦出血組前述操作相同，并于術(shù)后即刻開始腹腔注射G-CSF，按15 μg/kg 給藥，每天一次，連續(xù)給藥5 d。腦出血組、出血前組注射等量生理鹽水。實驗操作過程大鼠的體溫在恒溫墊的調(diào)節(jié)下維持在37.5 ℃左右。大鼠清醒后無偏癱體征，或血腫沿針道返流，或進入腦室者均棄用。

1.4 bcl-2、caspase-3 免疫組織化學染色 嚴格按照說明書步驟進行，在高倍光鏡下(×400)，隨機觀察并計數(shù)血腫周邊不重疊5 個視野陽性細胞數(shù)，計算其平均值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦出血后血腫周邊組織bcl-2 表達的變化 大鼠腦出血后4 h 起，出血周邊腦組織bcl-2表達明顯增高(P＜0.01)，24 h 達高峰，治療組bcl-2 表達4 h 起也明顯增高(P＜0.01)，24 h 達高峰，治療組各時間點bcl-2 表達明顯高于腦出血組(P＜0.01)(見表1)。

2.2 大鼠腦出血后血腫周邊組織caspase-3 表達的變化 大鼠腦出血后4 h 起，出血周邊腦組織caspase-3 表達明顯增高(P＜0.01)，24 h 達高峰，治療組caspase-3 表達4 h 起也明顯增高(P＜0.01)，24 h 達高峰，治療組各時間點caspase-3 表達明顯低于腦出血組(P＜0.01)(見表2)。

表1 腦出血后不同時間點bcl-2 陽性細胞數(shù)表達的變化(個，±s;n=8)

表1 腦出血后不同時間點bcl-2 陽性細胞數(shù)表達的變化(個，±s;n=8)

與腦出血前比較* P＜0.01;與腦出血對應(yīng)時間點比較﹟P＜0.01

表2 腦出血后不同時間點caspase-3 陽性細胞數(shù)表達的變化(個，±s;n=8)

表2 腦出血后不同時間點caspase-3 陽性細胞數(shù)表達的變化(個，±s;n=8)

與腦出血前比較* P＜0.01;與腦出血對應(yīng)時間點比較﹟P＜0.01

3 討論

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，是嚴重威協(xié)人類健康的疾病之一，目前仍缺乏有效的治療手段。出血性腦損傷不僅由于血腫的占位效應(yīng)及血腫對周邊組織的直接破壞，繼發(fā)性損傷也是出血性腦損傷的主要原因。近期研究認為細胞凋亡是出血性顱腦損傷的重要機制之一［8］。腦出血后血腫周圍缺血半暗帶出現(xiàn)大量凋亡細胞，說明凋亡機制參與了腦出血后腦組織的損傷過程［9］。

研究表明，神經(jīng)細胞的死亡主要表現(xiàn)為壞死和凋亡兩種形式。細胞凋亡是不同于細胞壞死的另一種細胞死亡形式，其過程受一系列相關(guān)基因的調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多細胞損傷及死亡均與細胞凋亡有關(guān)，且細胞發(fā)生凋亡之前必然有凋亡基因及凋亡相關(guān)蛋白的表達。目前認為，細胞凋亡的基因調(diào)控機制至少包含兩個重要機制，即bcl-2 家族蛋白的調(diào)控及胱氨酸蛋白酶的激活。bcl-2 是一種凋亡抑制基因，主要通過阻止細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)而發(fā)揮作用，它能夠阻止或降低染色質(zhì)濃縮和DNA 裂解的發(fā)生。其作用可能通過多種途徑而實現(xiàn)，其中研究較多的包括bc1-2 蛋白與凋亡蛋白Bax 形成異源二聚體抑制細胞凋亡的發(fā)生以及對凋亡關(guān)鍵性蛋白caspase-3 活化的抑制。其中bcl-2 家族在凋亡調(diào)控基因中位于重要地位，bcl-2 蛋白是一種膜合蛋白，存在于細胞的線粒體、核膜等處，主要生理功能是抑制細胞凋亡、延長細胞壽命。位于線粒體外膜的bcl-2 蛋白，通過調(diào)節(jié)線粒體功能，抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)，如Cyt-c、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等。其次，bcl-2 蛋白還抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，影響胞內(nèi)Ca2+重新分布，從而抑制某些依賴Ca2+的酶發(fā)揮酶解活性。bcl-2 還可通過抗氧化作用，抑制細胞超氧化合物的積累。bcl-2 與Bax 形成異源二聚體而競爭Bax/Bax 同源二聚體的形成，抑制細胞凋亡的產(chǎn)生［10］。bcl-2 基因家族在調(diào)節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，bcl-2 是重要的凋亡抑制基因，其抑制神經(jīng)細胞凋亡的可能機制為:直接抗氧化;抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白;抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白的細胞毒作用;抑制凋亡蛋白酶的激活，維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)［11］。Kingman 等［12，13］的研究認為，細胞凋亡與caspase 的蛋白酶解級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，而caspase-3 的激活是細胞凋亡的最終共同途徑。近來凋亡機制的研究發(fā)現(xiàn)，caspase 家族在凋亡過程中起重要作用，凋亡的最后過程是通過caspase 的激活而實現(xiàn)的。細胞凋亡過程受多種基因的調(diào)控，caspase 是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，而caspase-3 是caspase 家族中最重要的成員之一，是凋亡信號傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控基因［14，15］。caspase-3 為凋亡級聯(lián)反應(yīng)的終末執(zhí)行酶，它的激活是細胞凋亡的最終共同途徑，caspase-3 可以通過裂解DNA 修復(fù)蛋白或者直接破壞蛋白質(zhì)、核酸和胞膜的結(jié)構(gòu)，使細胞發(fā)生凋亡。正常情況下caspase 酶原沒有活性，必須通過激活，才能誘導(dǎo)凋亡。出血后啟動凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素還沒有確定。有作者認為腦出血的鄰近組織受輕微缺血影響［16］，大量激活的血液成分在出血后涌入大腦，其中細胞因子被活化后可導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)凋亡［17］。

細胞凋亡的調(diào)控包括促進和抑制兩個方面，只有當這兩方面相互平衡，神經(jīng)系統(tǒng)才能正常發(fā)育和維持正常功能。G-CSF 是細胞因子家族中的一員，主要功能是刺激骨髓粒細胞前體分化為中性粒細胞集落，并調(diào)節(jié)中性粒細胞的功能及其在體內(nèi)的分布。G-CSF 現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于臨床。有研究發(fā)現(xiàn)，GCSF 作為一種生物大分子可以穿過大鼠的血腦屏障，對局部腦缺血的大鼠模型具有神經(jīng)保護作用。G-CSF 可以緩解腦出血造成的神經(jīng)功能障礙，與其在腦缺血性疾病中的神經(jīng)保護作用相似。G-CSF 的神經(jīng)保護作用分析可能與以下機制有關(guān):(1)抗炎癥作用;(2)抗凋亡作用;(3)促進血管生成和神經(jīng)發(fā)生。

有研究表明，在腦出血早期應(yīng)用G-CSF 治療可明顯減輕神經(jīng)細胞的凋亡，減輕腦出血后的神經(jīng)損傷，對保護受損傷的神經(jīng)元、促進神經(jīng)修復(fù)有重要作用。G-CSF 對腦出血后損傷的神經(jīng)細胞具有保護作用，其可能的機制為上調(diào)bcl-2 的表達，抑制caspase-3 的表達，從而阻斷凋亡信號進一步傳導(dǎo)，保護腦出血后神經(jīng)元免于凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦出血周邊組織bcl-2 表達4 h開始升高(P＜0.01)，大約24 h 左右bcl-2 表達達峰值。G-CSF 干預(yù)后bcl-2 表達與腦出血組對應(yīng)時間點比較顯著上升(P＜0.01)。大鼠腦出血周邊組織caspase-3 表達4 h 開始升高(P＜0.01)，大約24 h 左右caspase-3 表達達峰值。G-CSF 干預(yù)后，caspase-3 表達與腦出血組對應(yīng)時間點比較顯著下降(P＜0.01)。G-CSF 可上調(diào)大鼠腦出血后bcl-2蛋白表達，抑制caspase-3 蛋白表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕損害的程度和范圍，對腦出血后腦損傷起到保護作用。

［1］Lu P，Jones LL，Snyder EY，et al.Neural stemcells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive hostaxonal growth after spinal cord injury［J］.Exp Neurol，2003，181(2):115-129.

［2］Kawada H，Takizawa S，Takanashi T，et al.Administration of hematopoietic cytokines in the subacute phase after cerebral infarction is effective for functional recovery facilitating proliferation of intrinsic neural stem/progenitor cells and transition of bone marrow-derived neuronal cells［J］.Circulation，2006，113:701-710.

［3］Shyu WC，Lin SZ，Yang HI，et al.Functional recovery of stroke rats induced by granulocyte colony-stimulating factorstimulated stem cells［J］.Circulation，2004，110:1847-1854.

［4］Schneider A，Kruger C，Steigleder T，et al.The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis［J］.J Clin Invest，2005，115:2083-2098.

［5］牛國忠，顧小林，華 潔，等.亞低溫治療實驗性大鼠腦出血的保護作用研究［J］.中華神經(jīng)外科雜志，1999，15:288-290.

［6］Deinsberg W，Vogel J，Kuschinsky W，et al.Experimental intracerebral hemorrhage:description of a double injection model in rats［J］.Neurol Res，1996，18:475-477.

［7］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.28-46.

［8］Zhang XQ，Zhang ZM，Yin XL，et al.Exploring the optimal operation time for patients with hypertensive intracerebral hemorrhage:tracking the expression and progress of cell apoptosis of prehematomal brain tissues［J］.Chin Med J，2010，123(10):1246-1250.

［9］Nakashima K，Yamashita K，Uesugi S，et al.Temporal and spatial profile apoptotic cell death in transient intracerebral mass lesion of the rat［J］.Neurotrauma，1999，16(2):143-145.

［10］Kumra1 A，Ozer E，Yilmaz O，et al.Neuroprotective effects of erythropoietin on hypoxic ischemic brain in neonatal rats［J］.Biol Neonate，2003，83(3):224-228.

［11］金惠銘主編.病理生理學［M］.第5 版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.178 -185.

［12］Kingman TA，Mendelow AD，Graham DI，et al.Experimental intracerebral mass:time-ralated effects on local cerebral blood flow［J］.J Neurosurg，1987(67):732-738.

［13］蔡文琴，阮懷珍，黎海蒂.醫(yī)用神經(jīng)生物學基礎(chǔ)［M］.重慶:西南師范大學出版社，2001.406-409.

［14］Markus HS.Cerebral perfusion and stroke［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2004，5:353-361.

［15］Memezawa H，Smith ML，Siesjo BK，et al.Penumbral tissues salvaged by reprefusion following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1992，23(4):552-559.

［16］Mac Manus JP，Linik MD.Gene expression induced by cerebral ischemic:an apoptotic perspective［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1997，17:815.

［17］Jenkins A，Mendelow AD，Graham DI，et al.Experimental intracerebral hemotoma，the role of blood constituents in early ischemia［J］.J Neurosurg，1990，4:45-49.