梔子苷預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護(hù)作用

涂 華，胡光強，陳碧瓊，杜 軍，杜 曦，余 錄

缺血預(yù)處理能誘導(dǎo)缺血耐受性腦保護(hù)已是不爭的事實，但基于其創(chuàng)傷性在臨床難以實施，因此，人們提出了藥物性預(yù)處理。目前已有多種自由基清除劑、抗血小板藥、麻醉藥等預(yù)處理對缺血損傷的腦保護(hù)研究，而中藥的預(yù)處理也越來越受到人們的關(guān)注［1］。BBB 是血管和腦之間一種選擇性地阻止某些物質(zhì)由血進(jìn)入腦的“屏障”結(jié)構(gòu)，腦缺血再灌注損傷引起B(yǎng)BB 的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化、血管通透性增加、血漿外滲，導(dǎo)致腦水腫及腦功能損害［2］。因此，藥物能否對BBB 發(fā)揮保護(hù)作用及作用的程度對患者的臨床治療和預(yù)后起到?jīng)Q定性的作用。梔子苷是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，也是中藥梔子的主要有效活性成分。本研究通過建立大鼠大腦中動脈缺血/再灌注損傷模型，觀察梔子苷預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷大鼠BBB 功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料 梔子苷(成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%，批號:MUST-14042110)，伊文思藍(lán)(美國Amersco 公司)，蛋白提取試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。AQP4 多克隆抗體(GeneTex)。GFAP、MMP-9、MMP-2 單克隆抗體、SABC 試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠)。預(yù)染蛋白Marker(美國bio-rad)。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天)，β-Actin(美國CST)。

1.2 動物及分組 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(270±20)g，由四川醫(yī)科大學(xué)SPF 級實驗動物中心提供。大鼠隨機分為3 組:假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組以及梔子苷(Gardenoside)預(yù)處理組。梔子苷在術(shù)前1 w 每日25 mg/kg灌胃給予，末次灌胃后半小時開始造模。假手術(shù)組和模型組術(shù)前每日給予等量的生理鹽水。

1.3 模型制備 參照課題組先前方法建立MCAO/R 模型［3］。首先用10%的水合氯醛(350 mg/kg)將大鼠麻醉后仰臥固定，切開頸部，分離暴露頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，然后結(jié)扎并游離頸外動脈，于頸外動脈近內(nèi)外動脈分叉處剪一楔形小口，從小口處往頸內(nèi)動脈插入一頭端被石蠟包裹(直徑約0.3 mm)的尼龍栓線，插入深度約18～20 mm，固定栓線并縫合切口。術(shù)后2 h 動物清醒后，參照Longa 評分法［4］對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為評分。將造模成功的大鼠再次麻醉，抽出栓線實現(xiàn)24 h 再灌。術(shù)中溫度維持在37 ℃，死亡大鼠予以相應(yīng)補充。

1.4 BBB 通透性檢測 通過紫外分光光度計檢測EB，其含量反應(yīng)BBB 通透性。再灌注23 h，經(jīng)尾靜脈注射2%的EB(3 ml/kg)，1 h 后將大鼠處死，取缺血側(cè)腦組織置于50%三氯醋酸勻漿、離心，提取上清液于波長620 nm 處測定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算EB 濃度。

1.5 免疫組化檢測GFAP、MMP-9 及MMP-2的表達(dá) 再灌后24 h，將大鼠麻醉，灌流取腦，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作厚度約5 μm 的冠狀切片。將切片脫蠟至水、3% H2O2中孵育20 min，微波加熱10 min 抗原修復(fù)，PBS 沖洗5 min 3 次，滴加5%的BSA 封閉，然后加一抗(GFAP，1∶100;MMP-9，1∶200;MMP-2，1∶200)37 ℃孵育2 h轉(zhuǎn)至4 ℃冰箱過夜。次日加羊抗兔IgG 孵育1 h、加SABC 孵育1 h。DAB 顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。在400 倍光鏡下取額葉皮質(zhì)區(qū)3 個不同的視野采圖，用Image proplus 6.0 軟件計算陽性表達(dá)的平均光密度(Mean density)。

1.6 Western blot 法檢測AQP4 的表達(dá) 每組3 只大鼠取缺血側(cè)皮質(zhì)置于-80 ℃低溫保存。按說明書提取總蛋白，取蛋白樣品與SDS 凝膠上樣緩沖液混合、煮沸變性，SDS-PAGE 電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉TBS 溶液封閉1 h。TBST 洗5 min×3 次，AQP4 多克隆抗體(1∶1000)及β-actin(1∶1000)室溫孵育1 h 移至4 ℃過夜，TBST 洗滌。用HRP 標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫孵育，洗膜后顯色。用凝膠分析軟件Quantity one 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量分析［5］。

2 結(jié)果

2.1 梔子苷預(yù)處理對腦缺血/再灌注大鼠腦組織EB 含量的影響 從表1 可以看出，再灌24 h 后，模型組大鼠腦組織EB 含量明顯增加，與假手術(shù)對照組比較有顯著性差異，而在梔子苷預(yù)處理組，EB 含量較之于模型組降低，統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示有顯著性差異(P＜0.05)。說明梔子苷預(yù)處理能從一定程度上減輕腦缺血再灌注引起的BBB 通透性改變(見表1)。

表1 梔子苷預(yù)處理對腦缺血/再灌注后大鼠腦組織EB含量的影響(±s，n=5)

表1 梔子苷預(yù)處理對腦缺血/再灌注后大鼠腦組織EB含量的影響(±s，n=5)

與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.2 梔子苷預(yù)處理對腦缺血/再灌注GFAP、MMP-9 及MMP-2 表達(dá)的影響 在假手術(shù)組額葉皮質(zhì)區(qū)，有極少量GFAP、MMP-9 及MMP-2 陽性表達(dá)。而在缺血再灌注模型組，GFAP 棕褐色陽性表達(dá)呈腫脹、增生的星型膠質(zhì)細(xì)胞狀，突起明顯增多增粗、延長。MMP-9 及MMP-2 的陽性表達(dá)也顯著增加。梔子苷預(yù)處理組3 種蛋白的陽性表達(dá)量較之于模型組有顯著減少，GFAP 染色顯示的星型膠質(zhì)細(xì)胞增生程度減輕。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明，3 組大鼠大腦額葉皮質(zhì)的陽性細(xì)胞平均光密度值(Mean density)值比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，見表2)。

表2 各組大鼠額葉皮質(zhì)區(qū)GFAP、MMP-9 及MMP-2 陽性表達(dá)的平均光密度值比較(±s，n=5)

表2 各組大鼠額葉皮質(zhì)區(qū)GFAP、MMP-9 及MMP-2 陽性表達(dá)的平均光密度值比較(±s，n=5)

與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.3 梔子苷預(yù)處理對腦缺血/再灌注后AQP4表達(dá)的影響 Western blot 實驗結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比較，模型組AQP4 蛋白的表達(dá)量顯著增高;而與模型組比梔子苷預(yù)處理組的AQP4 蛋白表達(dá)量降低，定量分析結(jié)果顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表3)。

表3 各組大鼠腦組織中AQP4 光密度值比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織中AQP4 光密度值比較(±s)

與模型組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

腦缺血預(yù)處理是指預(yù)先對腦進(jìn)行短暫的亞致死性缺血預(yù)處理，以減輕隨后發(fā)生的腦缺血再灌注所造成的致死性損傷。1990 年，Kitagawa 等［6］首次發(fā)現(xiàn)短暫性的腦缺血預(yù)處理具有神經(jīng)保護(hù)作用。隨著大量研究的不斷深入和發(fā)展，藥物預(yù)處理成為一種更具安全性、可行性的處理方法。特別是傳統(tǒng)中藥以其純天然、藥理作用廣泛、毒副作用少的絕對優(yōu)勢，同時符合疾病重在預(yù)防的慨念而成為預(yù)處理研究的熱點。研究表明，黃連解毒湯、白藜蘆醇等中藥的預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［7，8］。這些探索對缺血性腦血管疾病高危人群尤其是我國腦卒中人群具有極高的應(yīng)用價值。

BBB 是由內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突及周細(xì)胞組成的屏障結(jié)構(gòu)。在腦缺血損傷導(dǎo)致的一系列病理級聯(lián)反應(yīng)中，BBB 的完整性的破壞發(fā)揮著至關(guān)重要作用。缺血再灌注損傷使微血管及毛細(xì)血管中內(nèi)皮細(xì)胞破壞、基底膜成分降解，導(dǎo)致BBB 通透性增加、形成水腫以及出血轉(zhuǎn)化等。AQP4 是一種主導(dǎo)腦膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液、血管之間水調(diào)節(jié)和運輸?shù)闹匾鞍?，與腦水腫密切相關(guān)［9］。另有研究表明，基底膜成份的破壞對腦水腫和腦出血的形成甚至實質(zhì)的損傷更有意義［10］，而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)可降解大部分細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分，破壞基底膜的嚴(yán)整性。在MMPs 家族中，MMP-9 及MMP-2 與腦缺血后BBB 損傷的關(guān)系尤為密切，在缺血引起的血管源性水腫形成中發(fā)揮重要作用［11］。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，梔子具瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒之功效。梔子苷是植物梔子中的有效成分，能抗炎、抗氧化［12］。梔子苷作為一種水溶性的小分子量藥物，其在BBB 中的作用備受關(guān)注，體外模擬BBB 的研究證明，梔子苷以較高透過率通過BBB，可能因此阻止腦卒中的病理級聯(lián)反應(yīng)［13］。梔子苷在腦缺血再灌注損傷的研究表明其具有保護(hù)作用［14］。

EB 是一種小分子指示劑，正常情況下與血漿蛋白結(jié)合不通過BBB，而一旦BBB 破壞就會進(jìn)入腦組織，因此EB 含量可作為BBB 破壞程度的指標(biāo)。本研究運用梔子苷預(yù)處理，通過腦組織EB 含量的檢測發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后EB 含量增加即EB 從血管大量滲入腦組織，說明造模成功的大鼠BBB 的通透性增加，而梔子苷預(yù)處理減輕了BBB 的破壞程度。GFAP 染色顯示，作為BBB 重要成員之一的星型膠質(zhì)細(xì)胞，在經(jīng)梔子苷預(yù)處理后，其腫脹、增生程度改善。而MMP-9 及MMP-2 的表達(dá)降低，表明梔子苷預(yù)處理對維持基底膜的完整性起到一定作用。另外，經(jīng)Western blot 檢測到藥物處理組AQP4 蛋白量的下調(diào)，說明梔子苷可能減輕腦水腫程度。因此，綜上所述，梔子苷預(yù)處理可能對缺血再灌注BBB 的損傷有保護(hù)作用，該研究同時為梔子苷作為一種腦卒中預(yù)處理藥物提供了一定理論基礎(chǔ)。

［1］程 雪，王 剛，閔連秋.藥物預(yù)處理的腦保護(hù)作用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，12(14):886-889.

［2］Pillai DR，Dittmar MS，Baldaranov D，et al.Cerebral ischemia-reperfusion injury in rats-a 3 T MRI study on biphasic blood-brain barrier opening and the dynamics of edema formation［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29(11):1846-1855.

［3］余 錄，胡光強，陳碧瓊，等.人參皂苷Rb1 對大鼠腦缺血再灌注JAK2/STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(17):1932-1934.

［4］Longa E，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middie cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［5］Yu L，Chen C，Wang LF，et al.Neuroprotective effect of kaempferol glycosides against brain injury and neuroinflammation by inhibiting the activation of NF-κB and STAT3 in transient focal stroke［J］.PLoS One，2013，8(2):187.

［6］Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，et al.Ischemic tolerance phenomenon found in the brain［J］.Brain Res，1990，528(1):21-24.

［7］Zhang Q，Bian H，Li Y，et al.Preconditioning with the traditional Chinese medicine Huang-Lian-Jie-Du-Tang initiates HIF-1α-dependent neuroprotection against cerebral ischemia in rats［J］.J Ethnopharmacol，2014，154(2):443-452.

［8］李 珍，王斌生，孔德虎，等.白藜蘆醇預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(6):802-806.

［9］Papadopoulos MC，Verkman AS.Aquaporin-4 and brain edema［J］.Pediatr Nephrol，2007，22(6):778-784.

［10］Hamann GF，Okada Y，del Zoppo GJ.Hemorrhagic transformation and microvascular integrity during focal cerebral ischemia/reperfusion［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1996，16(6):1373-1378.

［11］Rosenberg GA，Estrada BS，Dencoff JE.Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain［J］.Stroke，1998，29(10):2189-2195.

［12］游偉良，平其能，孫敏捷，等.梔子苷的藥理學(xué)研究新進(jìn)展［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2012，36(4):158-162.

［13］高永紅，王永炎，盛 元，等.清開靈有效組分透過體外模擬血腦屏障的研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，28(2):26-28.

［14］李 敏，王 斌，唐志書，等.黃芩苷、梔子苷對大鼠腦缺血保護(hù)作用的機制［J］.中藥藥理與臨床，2012，28(3):34-36.