睡眠節(jié)律紊亂復(fù)制Alzheimer 樣大鼠模型的研究探討

李宜培，楊國俊，秦紫芳，靳 力，王 黎

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是多發(fā)生于老年人，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力下降為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。AD 發(fā)病機(jī)制迄今仍未徹底闡明，這與AD 患者相似的動(dòng)物模型未能真正建立起來密切相關(guān)［1］。理想的AD 動(dòng)物模型應(yīng)具備神經(jīng)細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid peptide，Aβ)沉積所形成的老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常磷酸化tau 蛋白聚集構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及皮質(zhì)、海馬選擇性的神經(jīng)元變性和缺失3 個(gè)條件［2］。目前AD 動(dòng)物模型多僅能模擬AD 病變中1～2 個(gè)病理學(xué)改變，且多數(shù)為創(chuàng)傷性的，這與AD 患者臨床起病的漸進(jìn)性和隱匿性不符。建立能有效復(fù)制AD 特征性病理改變且無創(chuàng)性的動(dòng)物模型是研究AD 發(fā)病機(jī)制和臨床研發(fā)治療藥物所必需的。

已有研究表明［3，4］，大約一半AD 患者發(fā)病早期伴有睡眠功能障礙，睡眠節(jié)律紊亂可能導(dǎo)致AD 的發(fā)生。人和動(dòng)物的生理節(jié)律與光線明暗變化節(jié)律密切相關(guān)，明暗周期的改變會(huì)嚴(yán)重影響生物的生理節(jié)律，特別是睡眠節(jié)律。

本實(shí)驗(yàn)通過持續(xù)光照改變大鼠的明暗周期，導(dǎo)致大鼠睡眠節(jié)律紊亂，觀察睡眠節(jié)律紊亂對(duì)大鼠空間記憶和超微結(jié)構(gòu)的改變，海馬組織Aβ 沉積和tau蛋白過度磷酸化的影響，為尋找新的復(fù)制AD 動(dòng)物模型方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組 清潔級(jí)雄性2 月齡Wistar大鼠36 只，體質(zhì)量200～250 g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。大鼠經(jīng)Morris 水迷宮篩選后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control group，正常晝夜節(jié)律)、弱光組(weak light group，WL;24 h 持續(xù)光照，照度400 lux)、強(qiáng)光組(strong light group，SL;24 h 持續(xù)光照，照度800 lux);每組12 只，20 ℃～25 ℃飼養(yǎng)，自由飲水和攝食。弱光組和強(qiáng)光組大鼠分別光照30 d。

1.2 主要試劑和儀器 Aβ 放免檢測(cè)試劑盒(中國人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫研究所)，多聚甲醛(美國BBI 試劑公司)，單克隆抗體PHF-1、單克隆抗體tau-1、多克隆抗體R134d、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(美國Santa Cruz 公司)，動(dòng)物組織總蛋白抽提試劑、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce 公司)，顯影定影試劑盒(武漢博士德公司);Morris 水迷宮系統(tǒng)(DMS-2 型，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，振蕩切片機(jī)(LEICA，S100 型，德國TPI)，全自動(dòng)γ 免疫計(jì)數(shù)器(中國西安)，F(xiàn)EI TecnaiG2 透射電子顯微鏡(荷蘭)，半干式電轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD)。

1.3 模型構(gòu)建 大鼠飼養(yǎng)與485 mm×350 mm×200 mm 規(guī)格的抗高溫聚碳酸酯鼠籠中，每鼠籠6 只大鼠。弱光組(WL)和強(qiáng)光組(SL)分別用25 瓦和40 瓦白熾燈泡懸于鼠籠中央正上方，距籠底約1 m，光照強(qiáng)度分別為400 Lux 和800 Lux。各實(shí)驗(yàn)組均用照度計(jì)測(cè)量光照強(qiáng)度并適當(dāng)調(diào)整燈泡高度。人工光照時(shí)間為7 pm 至次日7 am;自然光照時(shí)間是7 am至7 pm。除光照外，實(shí)驗(yàn)組大鼠飼養(yǎng)環(huán)境和正常對(duì)照組大鼠相同。

1.4 Morris 水迷宮行為學(xué)測(cè)試 水迷宮分為4個(gè)象限，大鼠每天在每個(gè)象限學(xué)習(xí)4 次，每次時(shí)限為60 s，即在60 s 內(nèi)大鼠未找到平臺(tái)者停止記錄，潛伏期記為60 s，大鼠由測(cè)試者引導(dǎo)站立平臺(tái)上，持續(xù)10 s。大鼠從平臺(tái)上取下，休息30～60 s 后再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。記錄第一象限的潛伏期為實(shí)驗(yàn)成績(jī)。該實(shí)驗(yàn)從第31 天連續(xù)訓(xùn)練大鼠7 d，記錄第7 天的潛伏期成績(jī)來反映大鼠的空間記憶能力。

1.5 淀粉樣蛋白Aβ 含量測(cè)定 行為學(xué)測(cè)試后，每組抽取4 只大鼠處死，剝離海馬，加入0 ℃生理鹽水，冰浴下超聲波勻漿，離心后取上清液，放免法測(cè)定Aβ 的含量，自動(dòng)γ 記數(shù)器記錄相關(guān)參數(shù)。

1.6 海馬電鏡標(biāo)本的制作及觀察 行為學(xué)測(cè)試完畢后，每組隨機(jī)抽取2 只用于透射電子顯微鏡取材。大鼠麻醉后灌注固定，切取海馬組織塊約1 mm3，經(jīng)漂洗液充分洗滌后，進(jìn)行梯度脫水。SPURR 包埋劑包埋后，荷蘭FEI TECNAIG212 透射式電鏡下觀察并照像。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 行為測(cè)試后，每組隨機(jī)選取2 只大鼠，麻醉后心臟灌注固定腦組織，取腦部組織后固定48 h，振蕩切片。一抗4 ℃過夜，ABC 法，DAB 顯色。檢測(cè)各組大鼠總tau 蛋白，pHF-1(識(shí)別tau 蛋白磷酸化的Ser396/404 位點(diǎn))和tau-1(識(shí)別tau 蛋白磷酸化的Ser199/202 位點(diǎn))的表達(dá)。

1.8 Western blot 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 行為測(cè)試后，每組隨機(jī)選取4 只大鼠，麻醉后斷頭，在冰面上剝離海馬，稱重。應(yīng)用Western blot 技術(shù)檢測(cè)各組大鼠總tau 蛋白，pHF-1 和tau-1 的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0 軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析及q 檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，弱光組和強(qiáng)光組大鼠毛色發(fā)黃，無精打采，行動(dòng)遲緩，處于抑制狀態(tài)。其潛伏期延長，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表1)。從游泳軌跡來看，弱光組和強(qiáng)光組呈曲線式搜索，正常對(duì)照組基本成直線式搜索。

2.2 海馬Aβ 放免測(cè)定結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，WL 組和SL 組Aβ 含量升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表1)。

2.3 大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的改變 正常對(duì)照組大鼠海馬電鏡下可見線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，突觸前后膜均一，厚度適中;突觸前膜內(nèi)的突觸小泡清晰可見，神經(jīng)軸突內(nèi)神經(jīng)細(xì)絲清晰，髓鞘板層排列均勻，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，游離核蛋白體(見圖1)。WL 組和SL組大鼠海馬神經(jīng)纖維變性，神經(jīng)元內(nèi)核變小，游離核蛋白體減少，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂褐素顆粒。線粒體結(jié)構(gòu)破壞，脊模糊，膜破壞;突觸減少、缺失，突觸膜密度降低，且不均一，突觸小泡數(shù)量減少，髓鞘崩解，神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)細(xì)絲減少(見圖2、圖3)。

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 R134d 抗體染色的結(jié)果顯示:正常對(duì)照組、弱光組、強(qiáng)光組總tau蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)比較無明顯差異。與正常對(duì)照組比較，弱光組和強(qiáng)光組PHF-1 表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)在海馬CA3區(qū)明顯增多，提示持續(xù)光照可引起tau 蛋白Ser396/404 位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化;而弱光和強(qiáng)光組tau-1 表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)在海馬CA3區(qū)明顯減少，提示持續(xù)光照可引起tau 蛋白的Ser199/202 位點(diǎn)磷酸化增強(qiáng)(見圖4)。

2.5 Western blot 結(jié)果 R134d 抗體檢測(cè)結(jié)果顯示正常對(duì)照組、弱光組、強(qiáng)光組總tau 蛋白含量無明顯差異，提示光照不影響總tau 蛋白的含量。與正常對(duì)照組比較，弱光和強(qiáng)光組海馬CA3區(qū)PHF-1抗體顯色明顯增強(qiáng)，tau-1 抗體顯色明顯減弱，提示持續(xù)光照可引起tau 蛋白Ser396/404 和Ser199/202位點(diǎn)發(fā)生過度磷酸化。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬Aβ 含量比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬Aβ 含量比較(±s，n=12)

與正常對(duì)照組比較* P＜0.05

3 討論

迄今為止，老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚未明確，理想的動(dòng)物模型是研究AD 的基礎(chǔ)。目前，研究者多采用毒性物質(zhì)注射入大鼠海馬復(fù)制AD 模型［5，6］。但這些模型注射藥物過程中均有創(chuàng)傷，和AD 患者的自然發(fā)病經(jīng)過大不相同，而且多數(shù)注射模型僅能表現(xiàn)出AD 典型病理改變的某一方面，影響了對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的深入研究。這就亟待人們尋找符合AD患者自然發(fā)病、非創(chuàng)傷性的而且能反映其特征性病理改變的動(dòng)物模型［7］。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)AD 患者的起病是隱匿性和漸進(jìn)性的，大約44%的AD 患者存在睡眠障礙［8，9］，并隨著病情的進(jìn)展和認(rèn)知功能的損害而逐步加重，這表明睡眠節(jié)律紊亂可能是AD 的病因。

線粒體是存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中的含有核外遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，是細(xì)胞的動(dòng)力化工廠，越來越多的證據(jù)表明，AD 的發(fā)生與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙密切相關(guān)［10～12］。突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間一種特化的細(xì)胞連結(jié)，是神經(jīng)元信號(hào)傳遞的重要結(jié)構(gòu)。大量研究表明，學(xué)習(xí)記憶與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性密切相關(guān)。突觸結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)中斷腦內(nèi)很多功能通路中的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其嚴(yán)重的是認(rèn)知和記憶障礙［13］。研究表明，海馬和皮質(zhì)突觸聯(lián)系的喪失是AD 的一個(gè)突出神經(jīng)病理學(xué)改變［14］。突觸脫失是AD 患者重要的病理改變之一，其脫失程度與癡呆嚴(yán)重程度成正比，因此被認(rèn)為是患者認(rèn)知功能下降的基礎(chǔ)［15］。因此，一個(gè)理想的AD 動(dòng)物模型除了能表現(xiàn)出AD 的兩大病理特征外，還應(yīng)有超微結(jié)構(gòu)的損傷即線粒體和神經(jīng)突觸的病理學(xué)改變。

本實(shí)驗(yàn)采用持續(xù)光照造成大鼠睡眠節(jié)律紊亂，結(jié)果發(fā)現(xiàn)持續(xù)光照可以導(dǎo)致大鼠空間記憶能力降低，海馬組織超微結(jié)構(gòu)損傷。而且持續(xù)光照可致大鼠海馬Aβ 含量增多，誘導(dǎo)大鼠海馬組織tau 蛋白Ser396/404 和Ser199/202 位點(diǎn)過度磷酸化，異常磷酸化的tau 蛋白主要分布在海馬的CA3區(qū)。因此，筆者認(rèn)為持續(xù)光照這種非創(chuàng)傷的方法可以通過模擬AD 患者睡眠功能紊亂，成功復(fù)制AD 樣動(dòng)物模型，是較理想的老年性癡呆模型，適用于AD 發(fā)病機(jī)制和藥物療效評(píng)價(jià)的研究。

圖1 正常對(duì)照組

圖2 弱光組

圖3 強(qiáng)光組

圖4 各組大鼠海馬tau 蛋白免疫組化結(jié)果(標(biāo)尺:500 μm)

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