GCs 對(duì)VD 大鼠行為學(xué)及海馬腦區(qū)tau 蛋白P-tau 蛋白、Aβ 淀粉樣蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

張艷梅，陳 金，鄔 偉，馬飛煜，楊 佳

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由各血管疾病因素引起的以認(rèn)知功能損害為主的獲得性智能損害綜合征，為老年期癡呆的主要類型之一。在導(dǎo)致VD 的多種腦血管疾病中，以慢性缺血性腦血管病最多見(jiàn)。研究證實(shí)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)特征性病理改變?yōu)槔夏臧?senile plaque，SP)，超微結(jié)構(gòu)分析證實(shí)Aβ 淀粉樣蛋白及P-tau 蛋白為老年斑的主要組分，但有關(guān)Aβ 淀粉樣蛋白及P-tau 在慢性缺血所致VD 發(fā)病過(guò)程中的變化情況卻鮮有報(bào)道。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為肉蓯蓉總苷(glycosides of cistanche，GCs)能起到神經(jīng)保護(hù)作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)GCs 對(duì)VD 患者認(rèn)知、行為、精神癥狀、日常生活及社會(huì)功能都有明顯的改善作用［1，2］。綜上所述，本研究采用2-VO 致局灶性腦缺血法誘導(dǎo)VD 大鼠模型，探討GCs 對(duì)VD 模型大鼠認(rèn)知功能改變及海馬腦區(qū)tau 蛋白、P-tau 蛋白、Aβ淀粉樣蛋白表達(dá)的影響，為探索VD 發(fā)病機(jī)制及防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性Wistar 大鼠22 只(湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，編號(hào)00 010751;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證號(hào):00014834)，周齡6 w，體質(zhì)量230～270 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，將大鼠隨機(jī)分為6 組:VD 模型組12 只、藥物對(duì)照組11 只(奧拉西坦，450 mg/kg/d)、GCs 高劑量治療組12 只(10 mg/kg/d)、GCs 中劑量治療組11 只(5 mg/kg/d)、GCs 低劑量治療組12 只(2.5 mg/kg/d)、假手術(shù)組10 只。

1.2 主要試劑及儀器 肉蓯蓉總苷由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院合成;通用型Morris 水迷宮裝置(上海吉量)。tau 蛋白、P-tau 蛋白、Aβ 淀粉樣蛋白試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型建立 VD 模型組［3］:10%水合氯醛(350 mg/kg，ip)麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid arteries，CCA)，永久性結(jié)扎。術(shù)后縫合切口，籠內(nèi)保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組:暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈后立即縫合。

1.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 將大鼠放入水迷宮進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，記錄大鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間(s)，計(jì)算出逃避潛伏期。

1.5 肉蓯蓉總苷干預(yù)治療 給藥方式腹腔注射，調(diào)整藥物濃度為給藥1 ml/只。模型組動(dòng)物腹腔注射等體積生理鹽水。連續(xù)治療14 d 后，進(jìn)行Morris 水迷宮試驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.6 大鼠海馬腦區(qū)tau 蛋白、P-tau 蛋白、β 淀粉樣蛋白表達(dá)研究 頸總動(dòng)脈結(jié)扎2 w 后斷頸處死大鼠先快速取出大鼠腦組織，然后將整個(gè)腦皮質(zhì)向下，沿大腦皮質(zhì)的腹側(cè)靠近小腦端用眼科鑷子剝離大腦皮質(zhì)，隨后迅速完整剝離鐮刀狀大鼠海馬腦組織，所有操作均冰浴中進(jìn)行。免疫組化SP 法檢測(cè)大鼠海馬腦組織tau 蛋白、P-tau 蛋白、β 淀粉樣蛋白表達(dá)，試劑盒均購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物生物工程有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟執(zhí)行。

實(shí)驗(yàn)步驟具體如下:(1)取材、切片常規(guī)脫臘至水;(2)3%雙氧水孵育10 min;試劑A 室溫下孵育15 min;7 μl 一抗用PBS 按1∶80 比例稀釋后濕盒37 ℃孵育2～3 h;(3)試劑B 室溫下孵育15 min;同上法滴加試劑C;(4)DAB 顯色;(5)染色后脫水風(fēng)干，樹(shù)膠封片。OlympusBS-51 顯微鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮定位航行結(jié)果 大鼠造模前均無(wú)明顯學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，造模后各組大鼠在5 d 的定位航行訓(xùn)練中，平均逃避潛伏期顯著改變，總體特點(diǎn)表現(xiàn)為隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)潛伏期顯著縮短，各組大鼠訓(xùn)練后平均潛伏期(見(jiàn)表1、圖1)，從圖中能發(fā)現(xiàn)隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，逃避潛伏期明顯縮短;GCs 低、中、高劑量組與模型組相比逃避潛伏期改善更明顯，其中GCs 高劑量組與假手術(shù)組的改善在第3、4 天基本相同，說(shuō)明GCs 具有顯著的改善記憶，保護(hù)神經(jīng)元的作用。VD 模型組大鼠潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.05)，GCs 治療后各組大鼠潛伏期明顯短于VD 模型組(P＜0.01)，但GCs中劑量組與藥物對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

2.2 免疫組化圖像及半定量分析 免疫組化SP 法檢測(cè)大鼠海馬腦組織tau 蛋白、P-tau 蛋白、β淀粉樣蛋白表達(dá)，標(biāo)本染色后立即使用OlympusBS-51 顯微鏡觀察，胞漿呈棕黃色染色為tau 蛋白、Ptau 蛋白及Aβ 淀粉樣蛋白。在每個(gè)標(biāo)本的上述各個(gè)區(qū)域隨機(jī)各測(cè)量5 個(gè)視野，每視野又選取5 個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)量平均灰度，取其平均值代表1 例標(biāo)本該區(qū)域的平均灰度值(見(jiàn)圖2)。Image J software v1.4對(duì)樣本的熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。免疫組化染色可見(jiàn)模型組3 種蛋白均有高表達(dá)，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而GCs 干預(yù)后表達(dá)灰度均明顯下降，與模型組相比均差異顯著(P＜0.05)，且隨GCs 治療劑量的上升而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表1 各組大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期比較(±s)

表1 各組大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期比較(±s)

與假手術(shù)組比較* P＜0.05;與模型組比較△P＜0.05

圖1 各組大鼠定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期比較

圖2 各組動(dòng)物各檢測(cè)指標(biāo)灰度值比較

3 討論

臨床常見(jiàn)老年癡呆的主要類型為AD 和VD，目前的專家共識(shí)認(rèn)為AD 在認(rèn)知功能障礙發(fā)病占首位，而VD 居于其次，流行病學(xué)資料顯示中國(guó)65 歲以上人群中VD 患病率為1.1%，約占癡呆總患病率的30%［4］，因此探索VD 發(fā)病機(jī)制及VD 有效防治藥物具有重要現(xiàn)實(shí)意義。雙側(cè)經(jīng)總動(dòng)脈結(jié)扎(2-VO)是一種公認(rèn)研究認(rèn)知功能障礙大鼠模型，它很好地模擬了VD 病理生理過(guò)程［3］。本實(shí)驗(yàn)用2-VO 方法制備VD 大鼠模型，Mories 水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組大鼠行為學(xué)改變情況。5 d 的定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期及游泳路徑顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，表明VD 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低。

GCs 從北疆產(chǎn)鹽生肉蓯蓉中提取，主要活性成分為苯乙醇苷類，研究發(fā)現(xiàn)GCs 為強(qiáng)抗氧化劑，能有效清除自由基，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用并促進(jìn)神經(jīng)功能回復(fù)，因此對(duì)于帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)變性病有確切療效［5］。本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射后大鼠空間探索能力改善明顯，與VD 模型組相比大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，由此表明，GCs 對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善作用。奧拉西坦臨床常用于改善認(rèn)知功能障礙患者的記憶和學(xué)習(xí)功能，我們的研究表明GCs 組與奧拉西坦藥物對(duì)照組逃避潛伏期沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因而提示可將兩者作為協(xié)同作用的藥物共同應(yīng)用。

Aβ 是由β 淀粉樣前體蛋白(APP)通過(guò)蛋白酶解途徑形成長(zhǎng)度為39～43 個(gè)氨基酸的片段，是構(gòu)成SP 的主要成分。分子生物學(xué)研究證實(shí)Aβ 淀粉樣蛋白在細(xì)胞基質(zhì)沉淀聚積可引起神經(jīng)元細(xì)胞毒性及神經(jīng)元纖維變性［6～8］;tau 蛋白是一種磷酸化蛋白，它連接軸突的微管并維持微管穩(wěn)定，與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能有關(guān)。病理情況下tau 蛋白被異常磷酸化，失去了維持微管運(yùn)輸?shù)哪芰?，以磷酸化形?P-tau)沉積在細(xì)胞內(nèi)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，進(jìn)而損害認(rèn)知功能［9～11］。研究報(bào)道P-tau 蛋白水平降低可改善癲癇發(fā)作造成的認(rèn)知功能下降［12］，本研究發(fā)現(xiàn)tau 蛋白、P-tau 蛋白及Aβ 淀粉樣蛋白在VD 大鼠海馬腦區(qū)表達(dá)均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而通過(guò)GCs 干預(yù)上述3 種蛋白表達(dá)量均顯著下降(P＜0.05);而Morris 水迷宮測(cè)試表明VD 大鼠的智能水平隨時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著下降，說(shuō)明Aβ 淀粉樣蛋白、tau 蛋白及P-tau 蛋白持續(xù)高表達(dá)可能是導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能障礙的原因之一。

綜上所述，VD 模型大鼠認(rèn)知功能減退與Aβ 淀粉樣蛋白、tau 蛋白及P-tau 表達(dá)增加有關(guān)，Aβ 淀粉樣蛋白和tau 蛋白相互影響并參與缺血后海馬神經(jīng)元的損害，造成VD 的發(fā)生、發(fā)展。

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