Dysferlinopathy 的免疫病理與基因突變分析

董明睿，汪 偉，盧 昕，舒曉明，焦勁松，劉尊敬，郭淮蓮

肌纖維膜蛋白Dysferlin 缺陷導致肌漿內囊泡運輸障礙及膜修復異常產(chǎn)生肢帶型肌營養(yǎng)不良2B(limb-girdle muscular dystrophy 2B，LGMD2B)、Miyoshi 肌病(miyoshi myopathy，MM)［1］和以脛前肌發(fā)病的遠端肌病(distal myopathy with anterior tibial onset，DMAT)［2］等臨床表型，稱為Dysferlinopathy，以常染色體隱性方式遺傳。本病發(fā)病機制主要涉及膜損傷后再修復途徑的破壞、T 小管的發(fā)育與維持、內源性炎癥因子的激活以及肌細胞融合和成熟延遲等因素［3，4］。與其他類型肌營養(yǎng)不良相比較，Dysferlinopathy 有較多的炎性細胞浸潤，呈現(xiàn)壞死性肌肉病病理特點，易與多發(fā)性肌炎、免疫介導性壞死性肌肉病相混肴造成誤診，導致患者接受了無效的皮質類固醇激素治療。因此對本病患者進行完善的免疫組織化學染色及基因檢測，明確其免疫病理特點及確定基因突變點具有重要意義。

1 資料和方法

1.1 病例收集 收集2013 年1 月-2015 年4月中日友好醫(yī)院神經(jīng)內科和風濕免疫科因四肢肌肉萎縮無力伴(或)肌酸激酶(CK)升高而就診的患者，詳細采集病史，包括性別、年齡、發(fā)病年齡、首發(fā)及主要癥狀、病情進展程度、生長發(fā)育史、家族史及除骨骼肌外其他器官受累情況如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、周圍神經(jīng)等。

1.2 肌肉活檢 所有患者簽署肌肉活檢知情同意書。采取開放式肌肉活檢，活檢部位:肱二頭肌、股四頭肌、脛前肌或腓腸肌。新鮮肌肉組織浸入經(jīng)液氮冷卻的異戊烷速凍后在冰凍切片機切片。肌肉組織病理染色包括:蘇木素-伊紅(H＆E)、改良Gomori(MGT)、細胞色素C 氧化酶(COX)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、高碘酸Schiff 反應(PAS)、油紅“O”(ORO)、還原型輔酶I 四氮唑還原酶(NADH)、三磷酸腺苷酶(ATPase)染色。IHC 染色:一抗包括抗Dysferlin、MHC-1、CD68、CD3、CD20、CD4、CD8、dystrophin-C、-rod、-N、sarcoglycan-alpha、-beta、-gamma、-delta 抗 體。每次IHC 染色將PBS 緩沖液替代一抗作為陰性對照;非肌營養(yǎng)不良、非肌炎肌肉組織作為正常對照。

1.3 PCR-測序法檢測DYSF 基因突變 所有患者簽署基因檢測知情同意書。EDTA 抗凝管留取患者外周血5 ml。采用標準酚-氯仿法提取基因組DNA。從人類基因組數(shù)據(jù)庫Gen Bank 中獲得DYSF的序列，應用Primer3 軟件分別對基因的第1～55 號外顯子設計引物。PCR 反應體系(20 μl)中包括:模板DNA 1 μl、2×Buffer(Mg2+)10 μl、引 物(2.5 mmol)各0.4 μl、dNTPs(2.5 mmol)4 μl、Taq 酶(5 U/μl)0.4 μl、水3.8 μl。反應條件:95 ℃熱變性3 min后，95 ℃30 s、60 ℃40 s、68 ℃3 min 30 s 共35個循環(huán)，68 ℃延長5 min。使用Multi Screen PCR 96-Well Plate(Millipore)對PCR 產(chǎn)物進行純化后測序。

2 結果

結合患者臨床特點、遺傳方式、肌肉組織IHC染色及基因檢測結果，共收集4 例Dysferlinopathy 患者。所有患者均符合以下特點:臨床以近端、遠端或近遠端同時受累的肌肉萎縮無力伴/或高CK 血癥;遺傳方式為常染色體隱性遺傳;肌肉活檢IHC 染色中dysferlin 蛋白缺乏;基因測序證實含有DYSF 基因復合雜合或純合突變。

2.1 臨床資料 患者1:19 歲男性?；颊咭荒臧肭案忻昂蟪霈F(xiàn)全身無力，2 個月后檢查發(fā)現(xiàn)CK 明顯升高，并出現(xiàn)上下樓梯困難，當?shù)蒯t(yī)院診斷為“多發(fā)性肌炎”并給予皮質類固醇激素治療。治療后肢體無力癥狀及CK 水平均無改善。癥狀逐漸加重，于我院就診時走路無力、蹲下站起困難、舉物困難。查體:四肢肌力Ⅳ級，無肌肉萎縮，腱反射正常。CK:7000～10854 IU/L。無家族史。肌電圖:肌源性損害?；颊?:28 歲女性。3 y 前無明顯誘因出現(xiàn)上樓梯費力，無力程度進行性加重，近半年自覺小腿細。自幼跑步時足跟不能著地。父母、姐及兒子體健。查體:雙上肢肌力正常、無肌萎縮，雙側髂腰肌肌力Ⅴ級、雙股四頭肌肌力Ⅳ級、雙足背屈Ⅴ-級、雙足趾屈Ⅳ-級。雙小腿肌肉萎縮。雙上肢腱反射正常引出、雙側膝跟腱反射未引出。CK:10000～16226 IU/L。無家族史。肌電圖:肌源性損害?；颊?:15 歲女性。4 y 前開始反復發(fā)作雙側大腿乏力，伴雙下肢緊繃感。逐漸出現(xiàn)蹲起及上下樓梯困難。查體，雙下肢近端肌力Ⅳ級，余肢體肌力正常，無肌萎縮，腱反射正常。CK:4300～7600 IU/L。肌電圖:肌源性損害。患者4:19 歲女性。2 y 前體檢發(fā)現(xiàn)CK 升高(5000 IU/L)，不伴肌肉無力，于當?shù)蒯t(yī)院接受激素和免疫抑制劑治療。治療后CK 水平無明顯下降，最高達16000 IU/L。1 y 前出現(xiàn)對稱性雙下肢無力，上樓梯困難，1 y 來無力程度無明顯加重?；颊咦杂左w育成績較好。無家族史。查體:頸肌及雙上肢肌力正常，雙下肢肌力Ⅳ-級，無肌萎縮，四肢腱反射對稱引出。肌電圖:右側髂腰肌MUP 多相波增多、可見衛(wèi)星電位，右側股四頭肌、脛前肌MUP 多相波增多。

2.2 一般病理特點及IHC 染色 4 例Dysferlinopathy 患者肌肉活檢的共同特點是肌纖維直徑變異增加、可見壞死及再生肌纖維、新鮮壞死肌纖維呈均質樣改變，符合壞死性肌肉病樣病理表現(xiàn)。無或僅伴隨輕度肌內衣纖維化，均有肌纖維內脂滴輕度增加。4 例患者的dystrophin-C、-rod、-N 以及sarcoglycan-alpha、-beta、-gamma、-delta 均表達陽性。有3例患者的IHC 染色顯示炎細胞以CD68+細胞為主;MHC-1 散在或彌漫表達于細胞膜，包括非壞死及再生肌纖維膜;C5b-9 補體主要沉積在壞死肌纖維內部(見表1、見圖1)。未見CD20+細胞。

2.3 DYSF 基因突變檢測結果 4 例患者中共發(fā)現(xiàn)8 種DYSF 突變:包括移碼突變c.2693delG;錯義突變c.757C＞T、c.5511C＞A、c.5516A＞T、c.863A＞T;剪切突變c.937+1G＞A、c.1181-2A＞G;無義突變c.1617C＞A。其中5 種為新發(fā)突變(見表2)。3 種新發(fā)錯義突變在種屬進化中具有保守性(見圖2)。

表1 Dysferlinopathy 患者一般病理特點和免疫組化染色

表2 Dysferlinopathy 患者的DYSF 突變

圖1 A:患者1 IHC 染色肌纖維膜dysferlin 陰性;B:皮肌炎患者dysferlin 在肌纖維膜陽性表達(做為陽性對照);C:患者1 HE 染色顯示少數(shù)壞死肌纖維;D:患者4 ORO 染色顯示肌纖維內輕度脂滴增多;E:患者4 MHC-1 在多數(shù)肌纖維膜陽性表達;F:患者4 C5b-9 補體在壞死肌纖維表達

圖2 患者1～3 的測序圖

3 討論

DYSF 位于常染色體2p13 區(qū)，由55 個外顯子組成，編碼分子量230 kDa 的跨膜蛋白dysferlin，后者大量表達在骨骼肌、心肌、腦、胎盤組織［5］以及單核細胞和巨噬細胞［6，7］。Dysferlin 蛋白C-端為跨膜結構域、N-端及其它蛋白結構均位于細胞胞漿內，參與肌肉收縮、以及細胞膜損傷部位囊泡聚集、膜融合過程，與肌細胞膜的再生和修復相關［8］。Dysferlin 參與的漿膜破損后修復過程是通過鈣離子觸發(fā)的、溶酶體參與的各種細胞內囊泡的胞吐作用完成的。經(jīng)過囊泡-囊泡、囊泡-漿膜的融合過程，大囊泡快速聚集在損傷處，轉運“膜補丁”以修補破損的膜結構［3］。Dysferlin 缺乏導致ATP 或其他內源性危險因子如S-100 蛋白、熱休克蛋白、HMGB1(High-mobility group box-1)釋放，這些因子通過toll-like 受體或P2X7 受體激活了炎性途徑［4］。

由于dysferlin 位于細胞膜并與鈣蛋白酶-3、小窩蛋白-3 臨近并相互作用，因此繼發(fā)性的dysferlin 蛋白缺乏也見于鈣蛋白酶-3 缺陷導致的LGMD2A［9］和小窩蛋白-3 缺陷導致的LGMD1C［10］。因此對通過IHC 染色疑診的Dysferlinopathy 病例進行基因檢測是必要的。在本組4 例患者中，dysferlin 缺失都是由DYSF 基因突變導致的，未發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性dysferlin 缺乏。當使用Western blot 方法測量肌肉組織中dysferlin 表達量減少到正常水平的20%以下時，通常是由于DYSF 基因突變所導致，用這個標準診斷Dysferlinopathy 的準確率達到100%［11］。如果未進行肌肉活檢，也可以測量血液中單核細胞的dysferlin 表達來代替肌肉組織的檢測，這種檢測方法使本病的診斷更便捷簡單［7］。目前國內大多數(shù)實驗不應用Western blot 方法進行臨床診斷。

Dysferlinopathy 均以隱性方式遺傳。我們共發(fā)現(xiàn)8 種突變，其中的移碼突變c.2693delG、錯義突變c.5511C＞A(D1837Q)、c.5516A＞T(Y1839F)、c.863A＞T(D288V)、無義突變c.1617C＞A 5 種是首次報道的新發(fā)突變。無義突變導致mRNA 翻譯提前終止、剪切突變導致外顯子跳躍(Exon skipping)，因此均被公認具有致病性，3 個新發(fā)的錯義突變的致病性具有不確定性。通過Polyphen2 和SIFT 功能預測，D1837Q、Y1839F、D288V3 個氨基酸替換均被預測為可能致病和致病;DYSF 第288、1837、1839 位氨基酸序列在種屬間具有高度的保守性，以上均是錯義突變具有致病性的重要依據(jù)?；颊? 含有3 種DYSF 突變，除13 號外顯子剪切位點處的突變外，另外兩處突變?yōu)槲恢门R近的兩處錯義突變，兩個錯義突變之一可能不具有致病性。

本病多數(shù)患者在10～20 歲之間起病，本組患者平均發(fā)病年齡17.5 歲?；颊? 以遠端肌群無力萎縮起病，臨床符合MM;患者3 以四肢近端無力為主，臨床符合LGMD2B;其他2 例同時出現(xiàn)近、遠端肌肉受累。患者2 自幼出現(xiàn)跑步時足跟不能著地的運動發(fā)育異常表現(xiàn)，其他3 例在嬰幼兒及少年期運動發(fā)育正常、體育成績良好。根據(jù)Klinge 等觀察:大多數(shù)Dysferlinopathy 患者在發(fā)病之前肌肉力量正常、體力活動方面表現(xiàn)良好［12］，而其他肢帶型肌營養(yǎng)不良在明顯的肌無力癥狀出現(xiàn)前常有體育運動成績欠佳等運動發(fā)育異常表現(xiàn)。除具有肌營養(yǎng)不良樣病理特點外，Dysferlinopathy 常呈現(xiàn)明顯的炎癥表現(xiàn)。在3 例患者的IHC 染色，我們觀察到MHC-1 在肌纖維膜散在或彌漫表達，包括非壞死肌纖維膜，提示免疫因素參與了疾病的病理過程。本病中炎性細胞以巨噬細胞為主，而免疫介導性壞死性肌肉病以細胞毒性CD4+T 細胞為主，多發(fā)性肌炎以CD8+T 淋巴細胞侵入MHC-1 陽性非壞死肌纖維為特點［13］。因此，CD4、CD8、CD68、MHC-1 等IHC 染色有助于Dysferlinopathy 與原發(fā)性炎性肌肉病相鑒別。細胞表面的補體C5b、6、7、8、9 形成膜表面的通道結構(MAC 膜攻擊復合體)，造成膜的穿孔損傷。C5b-9 補體主要位于壞死肌纖維內部［14］，這種MAC 的表達可見于大多數(shù)肌肉疾病，因此被認為在Dysferlinopathy 發(fā)病過程中不起關鍵作用。膜修復受損也導致脂肪從包裹的膜中釋放并在局部沉積，當脂肪細胞在肌纖維聚集，更多的甘油通過脂肪細胞產(chǎn)生，加速了肌病的病理生理過程并最終導致三聯(lián)體失去功能、改變鈣離子穩(wěn)態(tài)，進一步加重肌肉無力［15］。本組中4 例患者肌肉組織均有輕度的脂滴增多，這個結果從一定程度上支持Dysferlinopathy 中繼發(fā)于膜修復損傷的脂肪轉運障礙參與病理生理過程的理論。這種脂滴增多的情況在其他的肌營養(yǎng)不良出現(xiàn)并不廣泛。

很多研究者基于對Dysferlinopathy 發(fā)病機制的認知，在動物模型中嘗試了基因治療、細胞治療、小分子藥物治療［16］以及針對炎癥反應的皮質類固醇激素、免疫抑制及IvIg 治療［17］。盡管到目前為止臨床上仍無有效的治療方法，但正確的診斷可以使患者避免因誤診而接受錯誤的治療。這4 例患者中的3 例最初被診斷為“肌炎”并接受了皮質類固醇激素治療。詳盡的病史、完善的肌肉組織學及IHC 染色和基因檢測對肌肉病診斷具有重要意義。

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