銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF 的表達(dá)的影響

劉秀萍，鄧 方

缺血性腦血管病主要是由于血管病變引起血流中斷或減少，導(dǎo)致相應(yīng)血管供應(yīng)區(qū)缺血缺氧而發(fā)生一系列病理生理反應(yīng)。而促進(jìn)損傷區(qū)域局部血管再生，建立良好的側(cè)支循環(huán)是缺血后重要的代償機制［1］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)于1989 年由Ferara 等在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化，是胚胎期血管新生和血管形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。VEGF 及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)系統(tǒng)，在缺血性腦血管病的微循環(huán)重建過程中起著至關(guān)重要的作用，可能是腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)［2］。銀杏內(nèi)酯(ginkgolides，GK)和白果內(nèi)酯(bilobalide，BB)是銀杏葉制劑中最為有效的成份，但其對于腦缺血后血管生成方面卻鮮有文獻(xiàn)報道。為深入研究其對急性腦缺血再灌注損傷的作用機制，本研究從血管新生角度，觀察了GK 和BB 對腦缺血的保護作用及對缺血側(cè)皮質(zhì)VEGF 和VEGER-1 表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar 大鼠，體重260～280g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2013-0001。

1.2 藥物與試劑 GK(四川成都百裕公司提供，批號:20130801)和白果內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號:NZ130609)，兔抗大鼠VEGF 抗體，VEGFR-1 抗體，β-actin，羊抗兔二抗，免疫組化試劑盒(PV-6000，GBI)，BCA 蛋白定量試劑盒，濃縮型DAB 試劑盒、ECL 顯影液。

1.3 實驗分組 將實驗動物隨機分為假手術(shù)組(Sham 組)、MCAO+鹽水對照組(Saline 組)、MCAO+GK 組(10 mg/kg，GK 組)、MCAO+BB 組(10 mg/kg，BB 組)，每組6 只。每組動物于腦缺血再灌注前30 min 腹腔給藥，假手術(shù)組和鹽水對照組給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠腦缺血再灌注模型的制備 參照Zea Longa 改良線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。具體方法為:以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，碘伏消毒，經(jīng)頸部正中切口暴露頸動脈三角。手術(shù)分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈和頸總動脈，在頸外動脈近分叉處剪一“V”字形切口，將直徑為0.26 mm、賴氨酸包被的鈍性魚線線栓斜行插入，通過頸內(nèi)動脈推進(jìn)到大腦中動脈，插入約18～20 mm 遇有阻力時為止。縫合肌肉和皮膚，術(shù)中保持大鼠肛溫在37 ℃±0.5 ℃Sham 組不插線栓，余操作相同。

1.5 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定 按Zea Longa 5 分制評分法對大鼠進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn):0分:無神經(jīng)功能損傷癥狀;1 分:對側(cè)前爪不能完全伸展;2 分:向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3 分:向右側(cè)傾倒;4 分:不能自發(fā)行走，意識喪失。入組標(biāo)準(zhǔn)為:評分為1～3分，且無蛛網(wǎng)膜下腔出血。大鼠腦缺血2 h 再灌注12 h 后，麻醉后迅速取腦，于-20 ℃冰箱中速凍18 min，然后將腦組織放入腦槽中，沿腦組織冠狀切面切成5 片，隨后將腦片放入2%TTC 溶液中，37 ℃避光置水浴箱30 min。再將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h 后，數(shù)碼相機拍照，應(yīng)用圖像分析軟件計算腦片梗死面積。

1.6 腦組織病理組織學(xué)檢查 大鼠腦缺血2 h再灌注12 h 后，用10%水合氯醛麻醉，迅速開胸，用生理鹽水沖洗心臟，然后用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，置于相同灌注液，4 ℃后固定1 w，依次脫水透明浸蠟及包埋，常規(guī)HE 染色封片，光鏡下觀察。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測VEGF 及VEGFR-1的表達(dá) 取大鼠腦組織冰凍切片，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書操作，3% H2O2室溫孵育，滴加一抗(兔抗VEGF、VEGFR-1，工作濃度分別均為1∶200)后滴加二抗，經(jīng)蒸餾水沖洗、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽性細(xì)胞計數(shù):在400 倍光學(xué)顯微鏡下分別隨機選取5 個視野，計數(shù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)后取平均值。

1.8 Western blot 檢測VEGF 及VEGFR-1 的表達(dá) 取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)進(jìn)行蛋白提取，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白變性后行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜封閉，分別加入一抗(VEGF，1∶1000;VEGFR-1 抗體，1∶1000;β-actin，1∶2000)，4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育，ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用Image J 圖像分析測定Western blot 條帶灰度值，結(jié)果以VEGF 及VEGFR1 與β-actin 灰度值的比值顯示。

2 結(jié)果

2.1 GK 和BB 對腦缺血/再灌注大鼠腦梗死范圍及神經(jīng)功能缺損的影響 TTC 染色結(jié)果提示:假手術(shù)組腦組織未見梗死灶，Saline 組腦組織梗死面積百分比為(41.09±1.33);與Saline 組相比，GK 組和BB 組腦梗死范圍減小(梗死面積百分比分別為23.8±0.58 和26.97±0.73)(P＜0.01)，提示GK 和BB 對缺血/再灌注腦損傷有確切的保護作用。在神經(jīng)功能損傷方面，假手術(shù)組無神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，Saline 組均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷表現(xiàn)，GK 組和BB組則明顯改善大鼠神經(jīng)癥狀(P＜0.01，P＜0.05)。提示GK 和BB 對大鼠神經(jīng)功能損傷有明顯的改善作用(見表1、圖1)。

2.2 VEGF 及VEGFR-1 蛋白的表達(dá)變化VEGF 蛋白含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在GK 和BB 組，VEGF 蛋白表達(dá)較缺血再灌注組顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。VEGFR-1 蛋白的表達(dá)在各組間表達(dá)量基本相同，無統(tǒng)計學(xué)差異(見圖2)。

2.3 組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 組織切片經(jīng)HE 染色，于400×光鏡下觀察。Sham 組未見明顯病理改變，各種神經(jīng)細(xì)胞層次清晰，細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)多樣化，胞核界限清晰，胞質(zhì)均勻，可清晰見到細(xì)胞核。Saline組見大鼠腦缺血中心區(qū)大量神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，可見部分神經(jīng)元胞質(zhì)濃縮，胞核固縮、碎裂或溶解。GK 和BB 組與Saline 組相比，梗死區(qū)縮小，神經(jīng)元損傷程度減輕，細(xì)胞排列尚規(guī)則，殘存的細(xì)胞形態(tài)相對正常，GK 組殘留的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較BB 組稍多(見圖3)。

2.4 VEGF 及VEGFR-1 陽性細(xì)胞的表達(dá)變化組織切片經(jīng)免疫組化染色，于400×光鏡下觀察。Sham 組可見少量VEGF 及VEGFR-1 表達(dá)陽性細(xì)胞，分布于在脈絡(luò)叢及軟膜等處。缺血2 h/再灌注12 h 后，基底節(jié)處缺血病灶區(qū)可見VEGF 及VEGFR-1 免疫陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，主要分布在缺血病灶周邊的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)呈明顯棕黃色著色。GK 組和BB 組較Saline 組陽性表達(dá)部位相似，陽性表達(dá)率較Saline 組顯著增高(見圖4)。

表1 各組再灌注12 h 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比比較(±s，n=6)

表1 各組再灌注12 h 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積百分比比較(±s，n=6)

與假手術(shù)組比較#P＜0.01;與鹽水對照組比較* P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖1 大鼠腦缺血再灌注12 h 后神經(jīng)功能評分(A);腦梗死體積(B)

圖2 大鼠再灌注12 h Western blot 示VEGF、VEGFR-1 蛋白水平的表達(dá)

3 討論

本研究采用線栓法制備大鼠腦缺血/再灌注模型，從血管新生角度觀察了GK 和BB 的神經(jīng)保護作用。結(jié)果顯示:GK 和BB 能明顯改善缺血/再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，減小腦梗死范圍，減輕組織形態(tài)學(xué)改變。此前的研究證明，受損的腦組織可出現(xiàn)再塑性，神經(jīng)元發(fā)生的機制均與血管再通有重要的相關(guān)性，所以血管生成可以為大腦修復(fù)提供新的思路［3，4］。VEGF 是內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、加速新生血管形成、提高血管通透性等生物學(xué)特性，有類似于血管源性的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用。在腦缺血發(fā)生后，VEGF 能誘導(dǎo)新生血管形成，并使新生血管從正常組織向半暗帶及缺血中心區(qū)延伸，增加受累腦組織再灌注及供氧量，從而減輕腦缺血損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 參與了局部梗死周邊區(qū)的微血管形成作用和血液供應(yīng)的改善［5］。VEGF 還可間接地促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生并抑制細(xì)胞凋亡［6，7］。目前己經(jīng)證實，缺血及移植損傷能顯著上調(diào)神經(jīng)元及星狀細(xì)胞VEGF 的表達(dá)。在多種生理和病理情況下以旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，產(chǎn)生不同的生物作用，包括:(1)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移，以及體內(nèi)血管的生成;(2)增加血管通透性;(3)促進(jìn)血管支持物的生成等［8］。VEGFR-1 主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，其胞外部分對VEGF 具有很高的親和力，能以可溶形式存在［9］。VEGF 主要通過VEGFR-1在內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮作用［9］，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、微血管管型結(jié)構(gòu)形成及成熟血管生成［10］。

本研究免疫組化及Western blot 結(jié)果證明，大鼠缺血再灌注損傷后，缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)VEGF 的表達(dá)明顯提高，這可能是機體對抗缺血缺氧所致腦組織損害的一種自身保護方式。而GK 和BB 能刺激機體VEGF 分子表達(dá)上調(diào)，從而增強其誘導(dǎo)血管生成的功能，促進(jìn)了新生血管的形成和側(cè)支循環(huán)的重建，進(jìn)而增加局部腦血流量，提高腦組織對葡萄糖和氧的攝取，加快神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)并有效縮小腦梗死的最終體積。免疫組化結(jié)果顯示，在GK 組和BB 組中，VEGFR-1 的陽性細(xì)胞數(shù)較Saline 組明顯增多，表明GK 和BB 在促進(jìn)VEGF 表達(dá)的同時還能通過促進(jìn)其受體的表達(dá)進(jìn)一步增強缺血區(qū)血管生成。然而遺憾的是，Western blot 結(jié)果顯示不同組VEGFR-1 的表達(dá)量沒有明顯的差異。對這一結(jié)果，分析可能有以下幾方面的原因:首先，本研究選取的時間點為缺血2 h/再灌注12 h，可能GK 和BB 促進(jìn)VEGFR-1的表達(dá)上調(diào)的作用通過半定量的Western blot 還沒有充分顯現(xiàn)，延長觀察時間可能會發(fā)現(xiàn)其上調(diào)趨勢;其次，雖然給藥后免疫組化證實了表達(dá)VEGFR-1 的陽性細(xì)胞數(shù)增多，但是單個神經(jīng)元表達(dá)的VEGFR-1的量較小，其蛋白總量變化較小，提高檢測手段的靈敏度可能有助于檢出其變化情況;第三，VEGFR 存在兩種亞型，GK 和BB 可能對VEGFR-1 和VEGFR-2 均有作用，但可能對VEGFR-2 的影響更大，因此選用針對亞型的抗體可能更好地揭示其變化規(guī)律，尚需進(jìn)一步證實。但從以上實驗結(jié)果，仍可證實GK 和BB 確實可以通過促進(jìn)血管生成發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。銀杏葉制劑已廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病的臨床治療，針對其應(yīng)用價值和作用機制已進(jìn)行了很多研究，證明了銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯具有抗炎、抗凋亡等作用［11，12］。但此前研究所用的銀杏葉制劑多為混合成份，未能分辨其不同成份間的作用差異，機制探討難于深入。本研究選用了單一成份的銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯進(jìn)行研究，并比較了兩者的作用差異。從血管新生的角度，本研究證實了兩者可有效促進(jìn)血管生成，且銀杏內(nèi)酯組具有更顯著的變化趨勢。在隨后的研究中我們將進(jìn)一步深入探討。

本研究證實，銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可以通過激活血管內(nèi)皮生長因子上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)新生血管形成，在腦梗死再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，這可能為腦梗死患者的治療和預(yù)防提供新的靶點。

圖3 大鼠腦缺血再灌注12 h 各組大鼠HE 染色(HE×400)

圖4 大鼠缺血再灌注12 h 后免疫細(xì)胞化學(xué)染色VEGF、VEGFR-1 的表達(dá)(×400)

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