APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Aβ 水平與認(rèn)知行為學(xué)增齡性變化的研究概述

高堂珂綜述，薛衛(wèi)國(guó)審校

APPswe/PS1dE9 雙轉(zhuǎn)基因小鼠是目前阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的動(dòng)物模型，該模型是Jankowsky 實(shí)驗(yàn)室以AD 病理學(xué)理論中Aβ 級(jí)聯(lián)致病假說(shuō)為基礎(chǔ)［1］，培育出能夠表達(dá)人類APP 和PS1 突變基因的轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型［2］，該模型可在一定程度上模擬AD 的病理特征和漸進(jìn)性的病程。近年來(lái)，許多使用APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積量與其認(rèn)知功能減退并不成正比，小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積量與其月齡變化關(guān)系也沒(méi)有較為統(tǒng)一的結(jié)論。因此實(shí)驗(yàn)中往往需通過(guò)認(rèn)知行為學(xué)數(shù)據(jù)及Aβ 水平干預(yù)措施對(duì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，再進(jìn)行綜合分析，這樣產(chǎn)生的誤差會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。故本文將結(jié)合目前的研究文獻(xiàn)對(duì)該雙轉(zhuǎn)基因鼠表型中的Aβ 病理與行為學(xué)是否存在可能的相關(guān)性及二者與小鼠月齡的變化關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 不同月齡APP/PS1 小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中認(rèn)知功能的變化

目前用于APP/PS1 小鼠認(rèn)知能力的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方式主要為迷宮實(shí)驗(yàn)，迷宮實(shí)驗(yàn)中常用的檢測(cè)裝置有Morris 水迷宮、多臂水迷宮、T-型迷宮、十字迷宮實(shí)驗(yàn)等。實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1 小鼠出現(xiàn)認(rèn)知能力改變的月齡在不同迷宮實(shí)驗(yàn)裝置中檢測(cè)結(jié)果會(huì)有所不同。

1.1 APP/PS1 小鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能改變的月齡 在上述多種迷宮裝置中，Morris 水迷宮是最常用的評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶水平的實(shí)驗(yàn)裝置，主要的實(shí)驗(yàn)方法為:定位航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)分別對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)、空間記憶以及長(zhǎng)時(shí)程記憶能力進(jìn)行檢測(cè)［3］，“逃避潛伏期”是應(yīng)用最廣泛的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Jankowsky 的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)在2005 年的研究表明，8 月齡APP/PS1 小鼠在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置中已經(jīng)能夠檢測(cè)到認(rèn)知功能的改變［4］，而后的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)基因小鼠可能于6～8 月齡在Morries 水迷宮中開(kāi)始出現(xiàn)認(rèn)知功能改變［5］。而其他的迷宮實(shí)驗(yàn)裝置，尚未能發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)行為學(xué)改變?cè)慢g的規(guī)律。如Xiong［6］等則發(fā)現(xiàn)6 月齡的雙轉(zhuǎn)基因鼠在多臂水迷宮中進(jìn)入錯(cuò)誤臂的平均次數(shù)才開(kāi)始明顯的多于野生鼠，但OLeary［7］在巴恩斯迷宮中檢測(cè)到16 月齡雙轉(zhuǎn)鼠才與野生鼠明顯的認(rèn)知功能區(qū)別。綜上所述，不同的實(shí)驗(yàn)裝置檢測(cè)到雙轉(zhuǎn)鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能改變的月齡是不同的。即使是同一實(shí)驗(yàn)裝置，可能由于小鼠個(gè)體間的差異或?qū)嶒?yàn)方法操作的影響，檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有所不同。

1.2 隨著月齡的增加雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的變化FAD 患者的認(rèn)知功能會(huì)隨著病程的延長(zhǎng)而不斷下降。故用以模擬AD 病理規(guī)律的APP/PS1 雙轉(zhuǎn)小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)與月齡間也可能存在某種相關(guān)性，經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)的總結(jié)，在不同的迷宮實(shí)驗(yàn)裝置中月齡與認(rèn)知功能間的關(guān)系主要體現(xiàn)于兩個(gè)方面。一是隨著月齡的增加，雙轉(zhuǎn)基因鼠在迷宮實(shí)驗(yàn)中認(rèn)知功能損害逐漸加重;二是與野生鼠相比，月齡越大的雙轉(zhuǎn)基因鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶能力越差。在Morries 水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置中，大部分6～18 月齡區(qū)間的雙轉(zhuǎn)小鼠均可檢測(cè)到認(rèn)知能力呈逐漸下降的趨勢(shì)［8，9］。且低月齡(小于等于5月齡)雙轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比經(jīng)多次訓(xùn)練后，二者間逃避潛伏期下降趨勢(shì)差別很小。而(5 月齡以上)雙轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠同樣次數(shù)的訓(xùn)練后，其逃避潛伏期反映出明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降。在其他迷宮實(shí)驗(yàn)裝置，雙轉(zhuǎn)基因鼠與野生鼠相比逃避潛伏期也反應(yīng)出相同的趨勢(shì)［10，11］。綜上所述，在應(yīng)用迷宮裝置的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能與月齡間存在一定的規(guī)律，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可看出，隨著月齡的增加，與野生鼠相比APP/PS1 鼠的認(rèn)知功能受損程度在不斷加重，其學(xué)習(xí)記憶能力的損害可能最為明顯。

2 不同月齡小鼠腦內(nèi)Aβ 水平的情況

2.1 Aβ 沉積于APP/PS1 小鼠腦內(nèi)形成淀粉樣斑塊的實(shí)驗(yàn)檢測(cè) APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)模擬了Aβ 過(guò)量沉積，形成淀粉樣神經(jīng)炎性斑塊等人類AD 的病理變化。目前常用的APP/PS1 雙轉(zhuǎn)鼠模型Aβ 檢測(cè)指標(biāo)有，腦內(nèi)Aβ1-42和Aβ1-40、老年斑等。檢測(cè)Aβ 的實(shí)驗(yàn)方法有ELISA 檢測(cè)法、硫磺素S(Thioflavin-S)熒光染色檢測(cè)法等，前者用于腦組織中的Aβ1-40及Aβ1-42的觀察，后者用于腦內(nèi)纖維性β-淀粉樣蛋白斑塊的檢測(cè)。Jankowsky 認(rèn)為APP/PS1 小鼠［12］約在6 月齡即可見(jiàn)腦內(nèi)淀粉樣斑塊沉積，18 月齡時(shí)沉積程度最為嚴(yán)重。如Garcia［13］使用體內(nèi)雙光子顯微鏡直接觀察到小鼠在6～7 月齡腦內(nèi)出現(xiàn)淀粉樣斑塊，并用硫磺素-S 熒光染色法示4 月齡小鼠腦內(nèi)僅有極少量可檢測(cè)的斑塊，斑塊負(fù)荷甚至接近0%，6 月齡時(shí)斑塊數(shù)量約80/ mm2，斑塊負(fù)荷約1.7%。且發(fā)現(xiàn)同一實(shí)驗(yàn)中6 月齡鼠腦內(nèi)斑塊數(shù)量約為45 塊，8 月齡約為170 塊，12 月齡約為220 塊。平均斑塊面積和負(fù)荷也呈逐步上升趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)方法同樣可定位老年斑在小鼠腦內(nèi)的分布，在APP/PS1 小鼠皮質(zhì)和海馬中Aβ 淀粉樣沉積所形成的斑塊被染色后顯影最多。低月齡APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Aβ水平與同月齡野生鼠基本相同，約在4 月齡少量沉積，但直到6～7 月齡才能用ELISA 法檢測(cè)到。所檢測(cè)的Aβ 沉積總量在雙轉(zhuǎn)基因鼠4～12 月齡內(nèi)應(yīng)呈逐漸增加的趨勢(shì)［14］由于Aβ 在APP/PS1 小鼠腦內(nèi)以多種形式存在，可以肯定不可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的總量在腦內(nèi)的沉積呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但可溶性Aβ 量的變化則尚無(wú)定論。

2.2 Aβ1-40與Aβ1-42隨月齡比值的變化 APP/PS1 小鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白形成的速率與Aβ1-40∶ Aβ1-42的比率變化直接相關(guān)［15］。兩者中增加速度最快的可能與老年斑形成的相關(guān)性最大。由于不同實(shí)驗(yàn)中ELISA 檢測(cè)采用的勻漿方法、試劑盒等實(shí)驗(yàn)過(guò)程千差萬(wàn)別，因此計(jì)算Aβ1-40與Aβ1-42的比值是驗(yàn)證Aβ 致病性的最好方式。通常認(rèn)為6 月齡時(shí)Aβ1-40∶Aβ1-42通常約為0.75∶ 1。且隨著月齡的增加，Aβ1-40總量∶Aβ1-42總量的比值逐漸應(yīng)先增大后減小。綜上，APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積會(huì)隨著月齡的增加而加重，選擇6～7 月齡開(kāi)始檢測(cè)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積水平也許為最佳，但也有實(shí)驗(yàn)者對(duì)此持相反意見(jiàn)，認(rèn)為3 月齡開(kāi)始即可檢測(cè)到腦內(nèi)Aβ 沉積。一般認(rèn)為Aβ 沉積主要沉積與小鼠腦內(nèi)的皮質(zhì)顳側(cè)部與海馬［16］。Aβ1-42/1-40比值變化與月齡間可能沒(méi)有相關(guān)性，該比值可能為Aβ1-42的沉積獨(dú)立于Aβ1-40沉積的證據(jù)。同時(shí)也是判斷Aβ1-40和1-42致病性的最佳指標(biāo)。

3 小鼠腦內(nèi)Aβ 情況與認(rèn)知功能改變相關(guān)性評(píng)價(jià)

3.1 實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差影響認(rèn)知行為學(xué)及Aβ 水平數(shù)據(jù)系統(tǒng)誤差主要為性別、基因突變?cè)斐傻谋磉_(dá)差異、生長(zhǎng)環(huán)境等因素。由于AD 發(fā)病除了年齡因素外，還有性別、基因突變、教育程度等因素的影響。對(duì)于APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，因此我們根據(jù)AD 的發(fā)病過(guò)程，期望小鼠能夠在“高齡”時(shí)先出現(xiàn)Aβ 過(guò)量沉積形成老年斑，再產(chǎn)生行為學(xué)改變(學(xué)習(xí)記憶能力下降，認(rèn)知功能損害)。但事實(shí)上，許多因素影響了APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因鼠在AD 病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)。(1)性別，目前普遍認(rèn)為雄性APP/PS1 鼠在行為學(xué)檢測(cè)中出現(xiàn)認(rèn)知功能下降的月齡要晚于相同條件下飼養(yǎng)的雌性，雌性小鼠的Aβ1-40和1-42 水平以及出現(xiàn)的斑塊數(shù)量都要高于同月齡的雄性小鼠［17］。這可能是受到性激素的影響出現(xiàn)的結(jié)果。(2)小鼠傳代時(shí)的基因突變導(dǎo)致后代表達(dá)的差異。如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因(Bndf)，它的表達(dá)缺失會(huì)是造成APP/PS1 小鼠的過(guò)度肥胖，從而造成行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果的誤差。并且可以肯定其對(duì)ELISA 檢測(cè)法的結(jié)果有著影響。(3)小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的因素，2003 年Jankowsky 實(shí)驗(yàn)室探索性的檢測(cè)了飼養(yǎng)環(huán)境因素對(duì)小鼠腦內(nèi)Aβ 沉積的影響，發(fā)現(xiàn)APP/PS1 小鼠在外界刺激豐富的環(huán)境下長(zhǎng)大比在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房飼養(yǎng)長(zhǎng)大腦內(nèi)Aβ 的沉積量有很大區(qū)別。綜上，對(duì)于APP/PS1小鼠模型，存在多種外界及自身對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的系統(tǒng)誤差，這些誤差不可避免的要對(duì)小鼠的行為學(xué)檢測(cè)和腦內(nèi)Aβ 沉積過(guò)程造成影響。

3.2 從不同Aβ 致病理論的角度探究 Aβ 級(jí)聯(lián)假說(shuō)作為AD 發(fā)病的主要假說(shuō)，其并未完全闡明Aβ 如何造成認(rèn)知功能減退，因此學(xué)者們提出幾種假說(shuō)以更深入闡明Aβ 導(dǎo)致認(rèn)知功能減退的機(jī)制。(1)實(shí)驗(yàn)者們認(rèn)為這是由腦內(nèi)Aβ 的某種早期聚集形式導(dǎo)致，即“Aβ 寡聚體”。早期月齡Aβ 可溶性寡聚體早于Aβ 沉積形成板塊，產(chǎn)生神經(jīng)毒性影響突觸功能導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。之后老年斑塊沉積大量出現(xiàn)，此時(shí)寡聚體和淀粉樣斑塊共同存在于腦內(nèi)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性使主宰神經(jīng)認(rèn)知功能的神經(jīng)元、突觸的結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)一步損害。這也可以讓我們從病理學(xué)角度解釋為什么一些實(shí)驗(yàn)中小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降發(fā)生早于Aβ 過(guò)量沉積形成老年斑。(2)APP/PS1 小鼠個(gè)體間行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果的差異可能因?qū)W習(xí)記憶系統(tǒng)的不同方面對(duì)Aβ 沉積所產(chǎn)生毒性的敏感度不同。如情景記憶能力比空間參考記憶能力對(duì)Aβ1-42的變化更敏感，長(zhǎng)期記憶能力則可能受到寡聚體的直接影響。(3)寡聚體誘發(fā)的小鼠早期認(rèn)知功能下降是可逆的，即當(dāng)飼養(yǎng)過(guò)程中小鼠受到外界環(huán)境的影響或?qū)嶒?yàn)者的主觀行為對(duì)小鼠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行干預(yù)(如故意將模型組在離平臺(tái)遠(yuǎn)的位置入水)，可能導(dǎo)致認(rèn)知功能損害出現(xiàn)組間和組內(nèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。最后，大鼠的Morris 水迷宮任務(wù)是由海馬、紋狀體、丘腦、前腦以及小腦等多個(gè)腦區(qū)共同協(xié)調(diào)，任何腦區(qū)的損害或腦區(qū)間聯(lián)系的破壞都會(huì)影響這一功能的實(shí)現(xiàn)。多數(shù)以APP/PS1 小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，海馬內(nèi)Aβ 水平和老年斑密度遠(yuǎn)超過(guò)其他腦區(qū)，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)期記憶能力普遍有損害癥狀，這可能是與老年斑產(chǎn)生神經(jīng)毒性導(dǎo)致海馬內(nèi)神經(jīng)突觸損傷有關(guān)。綜上，Aβ 與小鼠認(rèn)知功能下降間的相關(guān)性仍然難以準(zhǔn)確得出結(jié)論。

4 小 結(jié)

APP/PS1 轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型成功模擬了AD 發(fā)病的某些方面，如行為學(xué)檢測(cè)中認(rèn)知功能隨月齡的增加而下降，腦內(nèi)Aβ 沉積隨著月齡的增長(zhǎng)而加重。Aβ 可能是AD 神經(jīng)認(rèn)知功能損害的始發(fā)因子，啟動(dòng)了神經(jīng)退行性變，所以APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠早期月齡的認(rèn)知功能改變與Aβ 水平存在相關(guān)但非線性關(guān)系。但小鼠腦內(nèi)存在多種形式的Aβ(腦間質(zhì)液和細(xì)胞內(nèi)的可溶性Aβ、纖維性Aβ、Aβ 寡聚體)。它們對(duì)認(rèn)知功能損害的大小及同步性尚不清楚。且神經(jīng)炎性斑塊中的Aβ 沉積可能是代謝的副產(chǎn)品，也許神經(jīng)炎性斑塊的程度和Aβ 水平不能用于神經(jīng)病理變化程度的評(píng)估。轉(zhuǎn)基因小鼠可用于AD 發(fā)病機(jī)制研究及療效評(píng)估研究。AD 發(fā)病與哪個(gè)腦區(qū)的哪種Aβ 相關(guān)尚需要進(jìn)一步深入研究;選取哪種Aβ 相關(guān)指標(biāo)也是療效評(píng)估的關(guān)鍵點(diǎn)。

［1］Rosenkranz SC，Geissen M，Hrter K，et al.Amyloid-precursor-proteinlowering small molecules for disease modifying therapy of Alzheimer’s disease［J］.PLoS One，2013，8(12):e82255.

［2］Meraz-Rios MA，F(xiàn)ranco-Bocanegra D，Toral Rios D，et al.Early onset Alzheimer’s disease and oxidative stress［J］.Oxid Med Cell Longev，2014，14:375 -968.

［3］Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1(2):848 -858.

［4］Jankowsky JL，Melnikova T，F(xiàn)adale DJ，et al.Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2005，25(21):5217 -5224.

［5］Kim TK，Han HE，Kim H，et al.Expression of the plant viral protease NIA in the brain of a mouse model of Alzheimer’s disease mitigates Aβ pathology and improves cognitive function［J］.Exp Mol Med，2012，44(12):740 -748.

［6］Xiong H，Callaghan D，Wodzinska J，et al.Biochemical and behavioral characterization of the double transgenic mouse model (APPswe/PS1dE9)of Alzheimer’s disease［J］.Neurosci Bull，2011，27(4):221-232.

［7］O’Leary TP，Brown RE.Visuo-spatial learning and memory deficits on the Barnes maze in the 16-month-old APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease［J］.Behav Brain Res，2009，201(1):120-127.

［8］Minkeviciene R，Ihalainen J，Malm T，et al.Age-related decrease in stimulated glutamate release and vesicular glutamate transporters in APP/PS1 transgenic and wild-type mice［J］.J Neurochem，2008，105(3):584-594.

［9］Gimbel DA，Nygaard HB，Coffey EE，et al.Memory impairment in transgenic Alzheimer mice requires cellular prion protein［J］.J Neurosci，2010，30(18):6367 -6374.

［10］Filali M，Lalonde R，Rivest S.Cognitive and non-cognitive behaviors in an APPswe/PS1 bigenic model of Alzheimer’s disease［J］.Genes Brain Behav，2009，8(2):143 -148.

［11］Cao D，Lu H，Lewis TL，et al.Intake of sucrose-sweetened water induces insulin resistance and exacerbates memory deficits and amyloidosis in a transgenic mouse model of Alzheimer disease［J］.J Biol Chem，2007，282(50):36275 -36282.

［12］Reiserer RS，Harrison FE，Syverud DC，et al.Impaired spatial learning in the APPSwe+PSEN1DE9 bigenic mouse model of Alzheimer’s disease［J］.Genes Brain Behav，2007，6(1):54 -65.

［13］Garcia-Alloza M，Gregory J，Kuchibhotla KV，et al.Cerebrovascular lesions induce transient β-amyloid deposition［J］.Brain，2011，134(12):3697 -3670.

［14］Lee JE，Han PL.An update of animal models of Alzheimer disease with a reevaluation of plaque depositions［J］.Exp Neurobiol，2013，22(2):84 -95.

［15］Holcomb L，Gordon MN，McGowan E，et al.Accelerated Alzheimertype phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes［J］.Nat Med，1998，4(1):97 -100.

［16］Liu Y，Yoo MJ，Savonenko A，et al.Amyloid pathology is associated with progressive monoaminergic neurodegeneration in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2008，28:13805 -13814.

［17］Wang J，Tanila H，Puolivli J，et al.Gender differences in the amount and deposition of amyloid beta in APPswe and PS1 double transgenic mice［J］.Neurobiol Dis，2003，14(3):318 -327.