宮頸癌中CSN6對(duì)E6AP的調(diào)節(jié)作用及其臨床意義

王超　宋昱　郭奇桑　劉艷梅　高蜀君

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，*宮頸疾病診療中心，上?！?00011)

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·論著·

宮頸癌中CSN6對(duì)E6AP的調(diào)節(jié)作用及其臨床意義

王超宋昱*郭奇桑*劉艷梅*高蜀君*

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，*宮頸疾病診療中心，上海200011)

摘要目的：探討宮頸癌中組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體亞單位6(constitutive photomorphogenesis 9 signalosome subunit 6，CSN6)對(duì)E6AP的調(diào)節(jié)作用。方法： 在癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中檢索CSN6和E6AP基因，比較分析其相關(guān)性。采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)CSN6對(duì)E6AP表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)的影響。通過在裸鼠皮下接種不同CSN6表達(dá)狀態(tài)的Hela細(xì)胞株建立動(dòng)物模型，觀察CSN6對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果：數(shù)據(jù)庫資料顯示，CSN6和E6AP在腫瘤中有過表達(dá)和突變的現(xiàn)象。CSN6可以上調(diào)E6AP蛋白的表達(dá)，抑制CSN6的表達(dá)可以使E6AP表達(dá)下降，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞周期停滯于G0-G1期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，敲除CSN6可以顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，且腫瘤中E6AP蛋白表達(dá)水平下降，p53蛋白表達(dá)水平增加。結(jié)論：CSN6可以通過上調(diào)E6AP蛋白的表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

關(guān)鍵詞宮頸癌；人乳頭瘤病毒；感染；組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體；E6AP

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性所有惡性腫瘤中位居第四，在15～44歲年齡段的女性的惡性腫瘤中位居第二。2012年的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，全世界每年新增宮頸癌病例數(shù)527 624例，死亡265 653例[1]。目前我國(guó)宮頸癌發(fā)病率高居世界第2位，僅次于智利，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)明顯。

宮頸癌的發(fā)病與持續(xù)性的人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染關(guān)系密切[2-3]。至少15種HPV亞型被列入高危型HPV(high risk HPV，HR-HPV)，可引起生殖道及非生殖道的惡性腫瘤，16和18型HPV在超過70%的宮頸癌中可被檢測(cè)出[4-5]。HR-HPV E6和E7蛋白是其編碼的主要癌蛋白。HR-HPV E6參與了多條凋亡通路的調(diào)控，其中最為經(jīng)典的是E6通過E6AP介導(dǎo)的p53泛素化降解。E6AP作為泛素連接酶，可與E6和p53形成三聚體，從而特異性介導(dǎo)p53的泛素化降解，阻斷凋亡信號(hào)的傳遞[6]。

組成型光形態(tài)發(fā)生因子9信號(hào)復(fù)合體(constitutive photomorphogenesis 9 signalosome，COP9 or CSN)是一種存在于真核細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)高度保守的多亞基蛋白復(fù)合體，與組成型光形態(tài)發(fā)生(constitutive photomorphogenesis，COP)現(xiàn)象密切相關(guān)[7]。CSN與26S蛋白酶體的19S“蓋子”復(fù)合物具有同源性；19S“蓋子”被認(rèn)為具有識(shí)別泛素化底物并將其傳送至蛋白水解核心復(fù)合物進(jìn)行降解的功能[8]；CSN被認(rèn)為是連接信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白降解的分子平臺(tái)[9]，在調(diào)控多聚泛素鏈降解中具有重要的催化作用[10]。大量的研究[11-13]證明：CSN能通過調(diào)控細(xì)胞的分裂和分化、影響信號(hào)傳導(dǎo)、活化細(xì)胞轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)DNA損傷應(yīng)答等多種途徑參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展；CSN的2個(gè)亞單位CSN5和CSN6在多種惡性腫瘤(例如乳腺癌[14]、肺癌[15-16]、甲狀腺癌[17]等)中呈高表達(dá)且影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

CSN6可以抑制MDM2的自身泛素化，使其在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，持續(xù)發(fā)揮泛素化降解p53的作用，導(dǎo)致p53對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)控作用丟失，促進(jìn)腫瘤形成[18]。有研究[19]證實(shí)，在宮頸癌中，MDM2-p53通路因HR-HPV E6的參與而特異性轉(zhuǎn)換為E6-E6-AP-p53通路。但目前宮頸癌中E6AP的上游調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，CSN6是否同樣可以通過E6AP促進(jìn)p53的降解，目前尚無相關(guān)報(bào)道，CSN6在宮頸癌中的作用也未見報(bào)道。因此，本研究探討了CSN6在宮頸癌中的作用以及其對(duì)E6AP和p53的影響。

1資料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑HPV陽性細(xì)胞系(Hela和Caski)、HPV陰性細(xì)胞系(C33a)以及正常細(xì)胞(HEK-293T)購自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品典藏中心(ATCC)。DMEM F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)購自美國(guó)Gibco公司。MG132(C2211)購自美國(guó)Sigma公司?？贵w來源如下：CSN6、 E6-AP購自瑞士ENZO life Sciences公司；p53、Flag(M2 monoclonal antibody)、Actin購自美國(guó)Sigma公司；Myc購自英國(guó)Abcam公司。Flag-CSN6和Myc-CSN6見參考文獻(xiàn)[18]。shRNA-CSN6、N-CSN6(1-170 aa)、C-CSN6(160-327 aa)、CSN6(S60A)和CSN6(S60D)突變體的構(gòu)建見參考文獻(xiàn)[15,20-21]。

1.2shRNA-CSN6穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建每60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中鋪入4×105個(gè)Hela細(xì)胞，18 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。重組慢病毒質(zhì)粒GIPZ12-pshRNA-CSN6和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑，用2 μg/mL嘌呤霉素(puromycin)進(jìn)行篩選，每隔48 h更換一次新鮮培養(yǎng)基，維持puromycin的濃度，持續(xù)培養(yǎng)至14 d左右可形成細(xì)胞克隆，挑選克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)和免疫共沉淀法吸凈培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(phospahate buffered saline，PBS)小心漂洗2次，加入預(yù)冷的含有蛋白酶/磷酸化酶抑制劑的1×裂解緩沖液[0.5L 1×裂解緩沖液組成成分：7.5 g 1 mol/L Tris(美國(guó)Fisher公司)，15 mL 5 mol/L NaCl(美國(guó)Fisher公司)，0.5 mL NP-40(美國(guó)USB Corp公司)，0.5 mL TritonX-100(美國(guó)Sigma公司)和1 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(美國(guó)Fisher公司)。蛋白酶/磷酸化酶抑制劑組分：5 mmol/L礬酸鈉(NaV)，1 mmol/L氟化鈉(NaF)，1 μmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，0.1 mg/mL胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)A，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)和1000×全蛋白酶抑制劑混合物(瑞士Roche公司)], 于4 ℃或冰上放置20 min裂解細(xì)胞，4 ℃以13 000 r/min離心15 min。將離心后的上清液分為2份：1份加入6×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)樣品緩沖液，混勻后于100 ℃煮沸10 min，作為總細(xì)胞裂解液于-20 ℃保存；另1份用于免疫沉淀，1 mL細(xì)胞裂解液加入10 μL Protein A/G瓊脂糖珠，于4 ℃共振1 h，以10 000 r/min離心10 min，取上清備用，將瓊脂糖珠分別與目的抗體、IgG抗體(陰性對(duì)照)混合并加入上面的上清液中，混勻器勻速旋轉(zhuǎn)(4 ℃過夜)；將免疫沉淀后的溶液于4 ℃以3000 r/min離心3 min，去上清液，用1×裂解緩沖液洗滌瓊脂糖珠，離心后棄上清液，共洗滌3次。將1×裂解緩沖液與6×SDS樣品緩沖液混合，于100 ℃煮沸10 min，作為免疫共沉淀樣本。最后將總細(xì)胞裂解液和免疫共沉淀樣本等量上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠并電泳，電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗后4 ℃反應(yīng)過夜。第2天洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.4細(xì)胞增殖測(cè)定采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速率。按照每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1、2、3天后，分別將20 μ LMTT加入各孔中并繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后每孔加入二甲基亞砜100 μL，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期抑制CSN6表達(dá)48 h后，消化并收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，加入490 μL工作濃度的結(jié)合緩沖液，振蕩混勻細(xì)胞，同時(shí)加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化吡啶(propidium iodide，PI)，室溫下避光染色20 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙參數(shù)分析，測(cè)定subG1率。用于檢測(cè)細(xì)胞周期的標(biāo)本用70%乙醇固定后再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6動(dòng)物模型選取4～5周齡雌性BALB/c裸鼠10只，來自德克薩斯MD安德森腫瘤中心動(dòng)物飼養(yǎng)中心。將10只裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各5只。實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下接種shRNA-CSN6穩(wěn)定細(xì)胞株(1×106個(gè)細(xì)胞重懸于0.1 mL PBS)，對(duì)照組接種與實(shí)驗(yàn)組等量的shRNA-VECTOR穩(wěn)定細(xì)胞株。自接種第5天起，每周測(cè)量腫瘤體積3次，直至裸鼠接受安樂死。

2結(jié)果

2.1在臨床宮頸癌患者中CSN6及E6AP的mRNA表達(dá)情況及與主要分子蛋白的相關(guān)性在http://www.cbioportal.org網(wǎng)站的癌癥和腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫里檢索CSN6和E6AP基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CSN6在大多數(shù)腫瘤中呈過表達(dá)(紅色)，見圖1；而E6AP多以突變?yōu)橹?，見圖2。在宮頸鱗狀上皮癌和頸管內(nèi)腺癌(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC)中發(fā)現(xiàn)，CSN6(基因名稱為COPS6)和E6AP(基因名稱為UBE3A)主要表現(xiàn)為mRNA水平的擴(kuò)增，COPS6在宮頸癌中無突變，UBE3A有3%的突變，二者在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和CESC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(pearson相關(guān)系數(shù)為-0.327，P<0.05)，見圖3。從TCGA上下載所有CESC患者的CSN6和E6AP的mRNA水平信息，共253例患者，采用Prism 6.0t-test檢驗(yàn)COPS6低水平組和高水平組的UBE3A表達(dá)差異，COPS6低水平組的UBE3A表達(dá)水平明顯高于COPS6高水平組(P<0.01)，見圖4。同時(shí)下載所有CESC患者的反時(shí)相蛋白的陣列(reverse-phase protein lysate array，RPPA)數(shù)據(jù)，共155例患者，根據(jù)患者的序列號(hào)合并患者的COPS6、UBE3A及RPPA數(shù)據(jù)，運(yùn)用R語言分別計(jì)算CSN6和E6AP與192種蛋白分子的相關(guān)性，COPS6與smad1、smad3、smad4、src-pY416、src-pY527、src、STAT3、STAT5、Stathmin蛋白分子水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，見圖5)，而UBE3A與192種蛋白分子沒有明顯相關(guān)性。

圖1　TCGA數(shù)據(jù)庫中CSN6 基因在腫瘤中的表達(dá)情況

圖2　TCGA數(shù)據(jù)庫中E6AP基因在腫瘤中的表達(dá)情況

圖3　TCGA數(shù)據(jù)庫中CSN6與E6AP基因表達(dá)的相關(guān)性

圖4　TCGA數(shù)據(jù)庫中253例CESC患者的

圖5　TCGA數(shù)據(jù)庫中CSN6 mRNA水平與RPPA中9種蛋白分子表達(dá)的相關(guān)性

2.2CSN6對(duì)E6AP表達(dá)的調(diào)節(jié)

2.2.1CSN6可與E6AP相互結(jié)合前述分析表明，CSN6和E6AP存在相關(guān)性。免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌Hela細(xì)胞株內(nèi)的CSN6蛋白可以和E6AP蛋白結(jié)合，見圖6。抑制CSN6的表達(dá)后，E6AP的表達(dá)減少，見圖7。

(IP：免疫共沉淀；IB：免疫印跡；WCL：全細(xì)胞裂解液)

2.2.2CSN6對(duì)E6AP的調(diào)節(jié)依賴HPV的感染為進(jìn)一步了解CSN6與E6AP的相關(guān)性，用myc-CSN6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了4株宮頸癌細(xì)胞系：Hela和Caski

(合并HR-HPV感染)，C33A(不合并HR-HPV感染，伴有p53突變)和人胚胎源腎上皮細(xì)胞株HEK-293T。結(jié)果顯示，HPV陽性細(xì)胞中，隨著外源性CSN6表達(dá)增加，E6AP表達(dá)水平呈劑量依賴性遞增；而在HPV陰性細(xì)胞中則無此現(xiàn)象；見圖8。

圖7　CSN6敲除對(duì)E6AP蛋白表達(dá)的影響

圖8　4種細(xì)胞系中過表達(dá)CSN6對(duì)E6AP蛋白表達(dá)的影響

2.3抑制CSN6后細(xì)胞增殖能力下降、凋亡增加MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shRNA-CSN6的Hela細(xì)胞的增殖能力明顯低于對(duì)照組，見圖9。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，CSN6的敲除增加了細(xì)胞的凋亡率并促進(jìn)細(xì)胞G0-G1期的停滯，見圖10a～10c。

2.4下調(diào)CSN6的表達(dá)可抑制腫瘤生長(zhǎng)為進(jìn)一步證實(shí)CSN6在宮頸癌中的作用，分別用感染CSN6 shRNA的Hela細(xì)胞和轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的Hela細(xì)胞接種裸鼠，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，CSN6敲除組腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制。Western blotting證實(shí)CSN6的敲除不僅降低E6AP蛋白表達(dá)水平，同時(shí)增加了p53蛋白表達(dá)水平，見圖11a、11b。

圖9　抑制CSN6對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響(MTT)

a：抑制CSN6可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞G0-G1期停滯(左下象限代表存活細(xì)胞，左上象限代表壞死細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞)；b：為a的統(tǒng)計(jì)柱狀圖；c：抑制CSN6促進(jìn)細(xì)胞G0-G1期停滯

圖10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

a：宮頸癌移植成瘤實(shí)驗(yàn)；b：Western blotting結(jié)果顯示，抑制CSN6可減少E6AP蛋白的表達(dá)水平，增加p53蛋白的表達(dá)水平，(#1~ #5分別為實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和編號(hào)1~5 裸鼠)

圖11下調(diào)CSN6抑制腫瘤生長(zhǎng)

3討論

目前認(rèn)為，HPV的E6、E7蛋白是與宮頸癌關(guān)系最密切的2個(gè)癌蛋白，對(duì)E6、E7蛋白作用機(jī)制的研究有望為宮頸癌的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。既往研究[22]證實(shí)，E6、E7蛋白均可以阻斷凋亡通路，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生化，而且E6的抗凋亡作用被認(rèn)為與p53/PUMA/Bax通路密不可分。E6AP介導(dǎo)了E6對(duì)p53的泛素化降解過程，預(yù)示著對(duì)E6AP的調(diào)節(jié)可能會(huì)成為宮頸癌靶向治療的目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與26S蛋白酶體的19S“蓋子”復(fù)合物具有同源性的CSN6可以正向調(diào)節(jié)HPV陽性細(xì)胞的E6AP水平，而對(duì)HPV陰性細(xì)胞沒有影響。CSN6表達(dá)水平越高，E6AP在細(xì)胞中越穩(wěn)定，降低CSN6表達(dá)水平可增加E6AP蛋白的水解，因此，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CSN6在蛋白水平上正向調(diào)節(jié)E6AP。這似乎與臨床患者中的mRNA水平分析結(jié)果不相吻合，253例宮頸癌患者的COPS6和UBE3A mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)?？赡茉蛴校?1)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HPV陽性情況下CSN6正向調(diào)節(jié)E6AP，但253例患者中絕大多數(shù)未提供HPV是否感染的信息，僅少數(shù)注明HPV16或18型感染。因此，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論并不適用于這253例患者；(2)體外實(shí)驗(yàn)從蛋白水平進(jìn)行研究，而臨床數(shù)據(jù)來自mRNA水平，由于體內(nèi)mRNA和蛋白表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，二者不存在可比性。

p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)性最強(qiáng)的基因之一，在細(xì)胞周期調(diào)控、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面有重要作用。既往研究證實(shí)，CSN6可以通過多種途徑調(diào)節(jié)p53。例如有關(guān)CSN6-MDM2軸，研究[16,18]發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌組織中CSN6與MDM2的表達(dá)呈正相關(guān)，CSN6與MDM2直接作用，作用的位點(diǎn)為MDM2的294-384aa，而MDM2自我泛素化的位點(diǎn)為賴氨酸364(位于MDM2與CSN6相互作用的區(qū)域內(nèi))。CSN6通過抑制MDM2的泛素化，增強(qiáng)MDM2的穩(wěn)定性，導(dǎo)致p53的降解。此外，還有CSN6-14-3-3ó-Akt軸。14-3-3ó蛋白作為一種潛在的腫瘤抑制因子，是p53的下游靶點(diǎn)，可以負(fù)性調(diào)節(jié)Akt[23-24]。 研究[21]發(fā)現(xiàn)，CSN6能夠通過穩(wěn)定COP1而介導(dǎo)14-3-3ó蛋白的泛素化降解，從而減少14-3-3ó蛋白對(duì)p53穩(wěn)定性的正向作用，該功能與MDM2無關(guān)。此外，14-3-3ó蛋白的減少可激活A(yù)kt蛋白，激活的Akt通過磷酸化MDM2的絲氨酸166和186位點(diǎn)使其磷酸化，從而經(jīng)MDM2途徑增強(qiáng)p53的泛素化和降解，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Xue等[15]還發(fā)現(xiàn)，Akt激酶可以磷酸化CSN6的絲氨酸60位點(diǎn)而使CSN6磷酸化，以減少泛素介導(dǎo)的CSN6降解，從而增加CSN6的穩(wěn)態(tài)表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致p53降解。本研究發(fā)現(xiàn)，除了以上途徑之外，CSN6還可以通過E6AP起到調(diào)節(jié)p53的作用。E6AP是泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzyme，E3)的HECT結(jié)構(gòu)域家族成員。HPV E6蛋白與E6AP結(jié)合后將活化的泛素轉(zhuǎn)移到p53蛋白上，最終p53蛋白在26S蛋白酶體的作用下沿泛素化降解途徑降解。CSN有8個(gè)亞單位，CSN1、2、3、4、7及8的C端均具有高度保守的PCI域(COP9蛋白酶體啟動(dòng)因子)，該結(jié)構(gòu)有助于CSN各亞基間的相互結(jié)合以共同構(gòu)建CSN復(fù)合體；而CSN5和CSN6的N端均具有高度保守的MPN域(Mpr1p-Pad1p的N端)，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑SN發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用非常重要[25-28]。 早期關(guān)于擬南芥的遺傳學(xué)研究[26]表明，CSN6的MPN結(jié)構(gòu)域?qū)τ跇?gòu)建CSN必不可少。本研究結(jié)果顯示，在HPV陽性細(xì)胞系中，CSN6的過表達(dá)增加了E6AP蛋白的表達(dá)水平；而且shCSN6組p53蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加，這也對(duì)應(yīng)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中shCSN6組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯較對(duì)照組緩慢的現(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌中CSN6對(duì)E6AP有正向調(diào)節(jié)作用，從而降低p53的穩(wěn)定性，這與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有關(guān)CSN6的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究，例如前面提到的CSN6與smad、STAT等的相關(guān)性。

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Regulatory Effect of Constitutive Photomorphogenesis 9 Signalosome Subunit 6 on E6AP in Cervical Cancer and Its Clinical Significance

WANGChaoSONGYu*GUOQisang*LIUYanmei*GAOShujun*DepartmentofGynecology,*MedicalCenterofDiagnosisandTreatmentforCervicalDiseases,ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity,Shanghai200011,China

AbstractObjective：To explore the role of constitutive photomorphogenesis 9 signalosome subunit 6(CSN6) in the regulation of E6AP in cervical cancer. Methods:CSN6 and E6AP genes were retrieved from The Cancer Genome Atlas(TCGA), and the correlation between them was analyzed. The effect of CSN6 on expression of E6AP and cytobiology was determined with transfection of plasmids and Western blotting,methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) and flow cytometry(FCM).Nude mice were subcutaneously injected with Hela cell strains with different expression levels of CSN6, so as to set up the animal model. And the effect of CSN6 on growth of tumors was observed. Results: The database showed the overexpression and the mutation of CSN6 and E6AP in cancer. CSN6 could up-regulate the expression of E6AP. The inhibition on CSN6 could decrease the expression level of E6AP and the proliferation of cells, and induce the G0-G1 arrest.Animal expreiment showed that knock-out of CSN6 significantly inhibited the tumor growth, decreasing E6AP level and increasing p53 level. Conclusions: CSN6 could contribute to the occurrence and progression of cervical cancer by up-regulating the expression of E6AP.

Key WordsCervical cancer；Human papilloma virus；Infection；Constitutive photomorphogenesis 9 signalosome；E6AP

通訊作者高蜀君，E-mail：shujun99@163.com

基金項(xiàng)目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：12ZR1403800)

中圖分類號(hào)R 737.33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A