偶氮染料降解氧化產(chǎn)物苯胺的液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定

李志剛

(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

偶氮染料降解氧化產(chǎn)物苯胺的液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定

李志剛

(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

采用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定由Fenton法降解含偶氮染料的印染廢水中的痕量苯胺。降解反應(yīng)溶液中的苯胺通過HLB固相萃取小柱凈化、富集后，在XR-ODS II柱上，以乙腈/5mmol/L乙酸銨+0.05%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧(ESI)電離正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)測定。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)采用的固相萃取小柱能有效地去除溶液中的Fe2+和干擾苯胺測定的化合物，苯胺在10.0～1000.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)為0.9993，回收率在93.0% ～98.8% 范圍，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)在3.2% ～6.9%之間，日間RSDs在4.8% ～6.3%之間，最低定量檢出限為2.0 μg/L。建立的方法簡便、干擾少、特異性強(qiáng)，應(yīng)用此法測定Fenton反應(yīng)液中的痕量苯胺取得了滿意的結(jié)果。

偶氮染料;氧化產(chǎn)物;苯胺;液相色譜-質(zhì)譜法

Fenton法以其設(shè)備簡單，能量消耗少，運(yùn)行成本低，工藝安全穩(wěn)定等特點(diǎn)目前已被廣泛用于有毒、有害、難生物降解等印染廢水的處理中，但是在利用Fenton法進(jìn)行印染廢水處理前，需要對其降解機(jī)制及工藝優(yōu)化進(jìn)行系列研究。苯胺作為偶氮染料的一種重要降解產(chǎn)物，對Fenton法降解機(jī)制和降解途徑的闡釋及工藝條件的優(yōu)化起到非常關(guān)鍵的作用，而苯胺是一種可經(jīng)皮膚吸收易引起慢性、急性中毒的具有中等毒性的化合物［1－3］，因此，在利用 Fenton法處理偶氮染料時(shí)，監(jiān)測溶液中降解產(chǎn)生的痕量苯胺顯得十分重要。

有關(guān)苯胺的檢測方法目前國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道有:萘乙二胺偶氮分光光度法［4］、紫外液相色譜法［5］、熒光液相色譜法［6－7］、氫火焰離子氣相色譜法［8－9］、示波極譜法［10］、氣/質(zhì)聯(lián)用法［11］和液/質(zhì)聯(lián)用法［12］等。分光光度法和紫外液相色譜法存在靈敏度低，抗干擾能力弱等不足，難以滿足Fenton法溶液中痕量苯胺監(jiān)測的要求，而熒光液相色譜法、氫火焰離子氣相色譜法以及示波極譜法均不能提供待測化合物的結(jié)構(gòu)信息，其定性能力不甚理想。氣/質(zhì)聯(lián)用法和液/質(zhì)聯(lián)用法因都具有定性能力強(qiáng)和檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用，特別是針對復(fù)雜基體中痕量有機(jī)物的定性定量測定，但在本文試驗(yàn)中，如果采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測，則需要對樣品進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換，否則會(huì)縮短色譜柱的壽命。為此，選擇采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品進(jìn)行測定。此外，考慮到經(jīng)過Fenton反應(yīng)后的溶液會(huì)含有較高濃度的Fe2+和其他干擾苯胺測定的化合物，采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，有效除去干擾物質(zhì)，獲得了理想的試驗(yàn)結(jié)果。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UFLC XR型超快速液相色譜儀，包括二元高壓輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和在線脫氣機(jī)(日本島津株式會(huì)社)，配API 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司);Milli-Q純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司);全玻璃溶劑過濾裝置(美國Waters公司);12孔固相萃取儀(美國 Supelco公司)。

試劑苯胺(0.989 mg/mL)(中國計(jì)量科學(xué)研究院)、甲醇、乙腈均為LC/MS級(美國Fisher公司)，甲酸、氨水、乙酸銨均為 HPLC級(德國 Merck公司)。HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，美國Waters公司)。試驗(yàn)用水均來自Milli-Q純水制備系統(tǒng)。標(biāo)準(zhǔn)中間液(10.0 mg/L):準(zhǔn)確吸取苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液101.0 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋后并定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)中間液的質(zhì)量濃度為10.0 mg/L，于4℃冰箱中保存，備用。

1.2 色-質(zhì)譜聯(lián)用條件

色譜條件:色譜柱為Shim-pack XR-ODS II柱(75mm ×2.0mm，2.2μm);流動(dòng)相:A 相為水(內(nèi)含5mmol/L乙酸銨+0.05%甲酸)，B相為乙腈/水(體積比為90∶10)(內(nèi)含5mmol/L乙酸銨+0.05%甲酸)，梯度洗脫，程序見表1。流速為150 μL/min;柱溫35℃;進(jìn)樣體積為5.0 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件為:離子源為電噴霧電離離子源(ESI);定量方式采用多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式(MRM);GS1壓力3.45×105Pa;IS電壓4500 V;CUR壓力1.38×105Pa;GS2流速3.45×105Pa;CAD氣壓4.83×104Pa;離子源溫度550℃;掃描時(shí)間50 ms;EP電壓10.0 V;CXP電壓10.0 V;DP電壓180 V;CE能量25 eV。苯胺的定量離子對m/z 94→m/z 77，定性離子對m/z 94→m/z 51。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列的制備

分別吸取苯胺標(biāo)準(zhǔn)中間液(10.0 mg/L)0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用水/乙腈(體積比為90∶10)稀釋并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。然后在選定的色-質(zhì)譜條件下測定，以目標(biāo)物濃度(C，μg/L)對色譜MRM峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.4 樣品的制備

準(zhǔn)確吸取5.0 mL的Fenton反應(yīng)溶液移入事先用3 mL甲醇、3 mL去離子水活化的HLB固相萃取小柱，抽干后，用30%甲醇溶液、5%氨水、5%甲酸和去離子水各3 mL分別進(jìn)行淋洗，最后用3 mL水/甲醇(體積比為1∶4)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，40℃氮?dú)獯抵两?，用?乙腈(體積比為90∶10)復(fù)溶后定容至1.0 mL，漩渦1 min，過0.2μm 的PTFE 濾膜后，進(jìn)樣，測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色/質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

針對流動(dòng)相，在之前所建的液相色譜紫外/熒光檢測方法中，使用的是水/乙腈體系，苯胺在C18色譜柱上有較理想的色譜響應(yīng)，但是此條件下苯胺的質(zhì)譜響應(yīng)并不理想，本文嘗試在水/乙腈體系中添加乙酸銨或甲酸作為流動(dòng)相改性劑來考察苯胺質(zhì)譜行為。結(jié)果表明，如果單獨(dú)在流動(dòng)相中添加甲酸，苯胺的質(zhì)譜響應(yīng)會(huì)隨著甲酸含量的增加(0～0.2%)而慢慢增大，但是其色譜保留時(shí)間慢慢變短，當(dāng)甲酸含量達(dá)到0.2%時(shí)，苯胺幾乎無保留;當(dāng)繼續(xù)添加5mmol/L乙酸銨進(jìn)入流動(dòng)相之后，流動(dòng)相形成了緩沖溶液，待測物的色譜保留時(shí)間得到了改善，而其質(zhì)譜響應(yīng)值又隨之降低。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終選擇在流動(dòng)相中添加0.05%甲酸和5mmol/L乙酸銨，在優(yōu)化后的流動(dòng)相條件下，苯胺的保留時(shí)間為2.7 min，而且質(zhì)譜相應(yīng)較高，能滿足檢測要求。圖1示出ESI(+)苯胺的MRM色譜圖。

圖1 苯胺MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of aniline

2.1.2 質(zhì)譜的定性確證分析

根據(jù)待測化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)采用ESI源在正離子模式下對目標(biāo)物質(zhì)譜信號(hào)及穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。采用質(zhì)譜儀的自動(dòng)化程序，將質(zhì)量濃度為100 μg/L的苯胺以10.0 μL/mim的速度通過蠕動(dòng)泵直接引入質(zhì)譜儀，觀察其質(zhì)譜行為。結(jié)果表明，在一級質(zhì)譜時(shí)，在ESI(+)模式下產(chǎn)生的碎片離子其基峰為苯胺的準(zhǔn)分子離子峰m/z 94.0［M+H］+，它可以作為目標(biāo)物定性分析的主要依據(jù)之一。同時(shí)，采用串聯(lián)質(zhì)譜對目標(biāo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步的參數(shù)優(yōu)化，獲得其二級質(zhì)譜圖，見圖 2。由圖可知，質(zhì)譜圖中m/z 94.0為苯胺分子結(jié)構(gòu)中的氨基與1個(gè)氫離子結(jié)合后形成的準(zhǔn)分子離子［M+H］+，m/z 77.0為苯胺分子離子裂解脫去1個(gè)中性氨(NH3)分子后形成的碎片離子［M+H-NH3］+，而 m/z 51.0是碎片離子［M+H-NH3］+繼續(xù)開環(huán)并脫去1個(gè)中性分子乙炔(C2H2)后形成的［M+H-NH3-C2H2］+。根據(jù)碎片離子的響應(yīng)程度，試驗(yàn)選擇m/z 94→m/z 77為定量離子對，m/z 94→m/z 51為定性離子對，對Fenton反應(yīng)液中存在的痕量苯胺進(jìn)行定性和定量測定。

圖2 苯胺二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectrum of aniline

2.2 固相萃取柱的選擇與優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

由于Fenton反應(yīng)后的溶液會(huì)存在較高濃度的Fe2+和干擾苯胺測定的化合物，采用固相萃取法對樣品進(jìn)行預(yù)處理，固相萃取具有凈化能力強(qiáng)，濃縮倍數(shù)高等特點(diǎn)。根據(jù)被測化合物苯胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及樣品基體的基本特性，嘗試使用以聚苯乙烯-二乙烯基苯-吡咯烷酮作為填料的Oasis HLB固相萃取小柱。檢測結(jié)果表明，建立的方法能獲得滿意的結(jié)果，具有操作簡單，回收率高且穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

2.2.2 固相萃取淋洗洗脫條件的優(yōu)化

為最大程度減少基質(zhì)的干擾，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度，進(jìn)一步對HLB小柱的淋洗和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)分別采用含20%、30%、40%、60%、80%、90%以及100%的甲醇/水溶液3.0 mL進(jìn)行淋洗和洗脫。表2示出洗脫回收率與洗脫溶液的關(guān)系。由表可知，當(dāng)采用20%和30%甲醇/水溶液3.0 mL進(jìn)行洗脫，苯胺均未被洗脫。而當(dāng)用40%甲醇/水溶液3.0 mL進(jìn)行洗脫時(shí)，有少量苯胺被洗脫，隨著甲醇用量的不斷增加，被洗脫的苯胺越來越多，當(dāng)甲醇用量達(dá)到80%時(shí)，其回收率已接近100%，為保證苯胺有較高的回收率，并能將基質(zhì)干擾降至最低，采用30%甲醇/水(v/v)溶液作為淋洗液，80%甲醇/水(v/v)溶液作為洗脫劑，在此條件下對樣品進(jìn)行凈化，可以保證苯胺既有好的回收率，又可以把基質(zhì)干擾降到較低的水平，此外，試驗(yàn)還在淋洗步驟中添加5%甲酸和5%氨水，在確保目標(biāo)化合物不損失的前提下，可以除去部分雜質(zhì)。

表2 洗脫液與洗脫率的關(guān)系Tab.2 Relationship between eluate and eluting ratio%

2.3 方法線性范圍和檢出限

根據(jù)1.3小節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)系列的制備，進(jìn)樣測定后，其典型的線性回歸方程為A=4.86×103C+16.3，回歸系數(shù)(r)為0.9993，線性范圍為 10.0～1000.0 μg/L。苯胺的檢出限(LOD)為0.6 μg/L，最低定量檢出限(LOQ)為2.0 μg/L。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)和精密度

取不含苯胺的Fenton反應(yīng)溶液若干份，分別準(zhǔn)確加入低、中、高3個(gè)不同含量的苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，使溶液中苯胺的質(zhì)量濃度分別為 5.0、50.0、150.0 μg/L，按照1.4小節(jié)中的樣品處理操作，每天每個(gè)濃度平行測定6次，計(jì)算其日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。連續(xù)3 d，每天平行測定6次，計(jì)算其日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。可知，苯胺的加標(biāo)回收率在93.0% ～98.8%之間，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2% ～6.9%之間，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.8% ～6.3%之間。

表3 方法的加收率和精密度(苯胺)Tab.3 Recoveries and precisions of proposed method

2.5 實(shí)際樣品的降解動(dòng)力學(xué)研究

利用所建方法，對Fenton反應(yīng)溶液中偶氮染料降解的氧化產(chǎn)物苯胺進(jìn)行監(jiān)測，每隔30 min采集1份樣本進(jìn)行檢測，共檢測樣品6份。結(jié)果表明，苯胺在Fenton反應(yīng)開始后60 min達(dá)到最大值36.2 μg/L，隨后慢慢下降，苯胺在此降解過程中始終存在，但濃度較低，這主要可能是由于降解產(chǎn)生的苯胺很快會(huì)與溶液中的其他物質(zhì)作用形成更為穩(wěn)定的化合物或進(jìn)一步自身降解。

3 結(jié)論

本文試驗(yàn)建立了一種簡單、快速的檢測Fenton反應(yīng)溶液中偶氮染料的降解氧化產(chǎn)物痕量苯胺的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜方法，建立的方法回收率高，穩(wěn)定性好，可用于偶氮染料的Fenton法降解的機(jī)制及其動(dòng)力學(xué)研究。

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Determination of oxidative product aniline in degradation azo dye by liquid-phase chromatography coupled with mass spectrometry

LI Zhigang
(Zhejiang Industry Polytechnic College，Shaoxing，Zhejiang 312000，China)

A method for the determination of trace aniline in degradation of printing and dyeing wastewater containing azo dye using the Fenton by liquid chromatography coupled with mass spectrometry was developed.After aniline in the Fenton's reaction solution was cleaned and enriched by the HLB cartridges，the separation was performed on an XR-ODS II column by using the mobile phase of acetonitrile，0.05%formic acid and 5mmol/L ammonium acetate solution in gradient elution.Detection was carried out by LC-MS/MS using a positive electrospray ionization interface in the multi-reaction monitoring(MRM)mode.The results show that the HLB cartridge can effectively remove Fe2+and interfering substance from the Fenton's reaction solution.Calibration curve was linear within the range of 10.0 －1000.0 μg/L with a correlation coefficient 0.9993，and the limit of quantification(LOQ)was 2.0 μg/L.The extraction recoveries were between 93.0% －98.8%，and the intra-day RSDs were of 3.2% －6.9%，and the inter-day RSDs were of 4.8% －6.3%.The developed method is simple，less in disturbance and good in specificity for the satisfactory determination of trace aniline in the Fenton degradation azo dye solution.

azo dye;oxidative product;aniline;LC-MS/MS

TS 197

A

10.13475/j.fzxb.20140401605

2014－04－04

2014－12－09

李志剛(1966—)，男，高級工程師，碩士。研究方向?yàn)槿菊录夹g(shù)。E-mail:nblzg66@163.com。