氟對大鼠心肌細胞凋亡及p53蛋白表達的影響*

吳起清沈岳良劉開泰鐘近潔△(.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南永州 4500; .新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 80054; .中國疾病預(yù)防控制中心農(nóng)村改水技術(shù)指導(dǎo)中心,北京 000)

氟對大鼠心肌細胞凋亡及p53蛋白表達的影響*

吳起清1沈岳良2劉開泰3鐘近潔2△
(1.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南永州 425100; 2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830054; 3.中國疾病預(yù)防控制中心農(nóng)村改水技術(shù)指導(dǎo)中心,北京 102200)

摘要目的:研究氟化鈉對Wistar大鼠心肌細胞凋亡的影響,并初步探討其機制。方法:40只3~4周齡健康雄性Wistar大鼠,隨機分為氟化鈉25、50、100、150 mg·L-14個實驗組和一個對照組,實驗組每日飲用含不同氟化鈉濃度的蒸餾水,對照組飲用正常蒸餾水,復(fù)制慢性氟中毒大鼠動物模型。實驗開始和6個月時各描記心電圖一次,實驗期結(jié)束后處死各組大鼠切取心肌組織;采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)d UTP的缺口末端標記法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)測定心肌細胞凋亡情況。運用流式細胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)定量檢測p53蛋白表達。結(jié)果:(1)心電圖顯示:氟化鈉100 mg·L-1和150 mg·L-1組氟中毒大鼠Q-T間期與對照組相比明顯縮短(P<0.05)。(2)氟化鈉100 mg·L-1組和150 mg·L-1組心肌細胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.01),且相關(guān)基因p53的表達也明顯高于對照組(P<0.01)。結(jié)論:氟可導(dǎo)致心肌細胞凋亡,p53參與并介導(dǎo)細胞凋亡。

關(guān)鍵詞:氟;心肌;細胞凋亡;p53基因

大量研究結(jié)果表明,過量氟可導(dǎo)致機體多種細胞發(fā)生凋亡[1-2]。P53蛋白是抑癌基因p53的表達產(chǎn)物,對細胞凋亡和腫瘤細胞的增殖、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用,是關(guān)鍵性調(diào)控分子之一[3]。有關(guān)氟對心臟的損傷,氟中毒病區(qū)現(xiàn)場檢查顯示氟與心臟病發(fā)病相關(guān),氟中毒病區(qū)人群觀察到心臟損害表現(xiàn)[4];在實驗研究方面,無論是動物實驗還是體外實驗均證實氟可引起心臟損傷[5],但其毒性作用機制目前尚不十分清楚。因此本文擬選用Wistar大鼠經(jīng)飲水投氟復(fù)制氟中毒動物模型,通過檢測氟中毒大鼠心肌細胞凋亡率及其相關(guān)基因p53來探討氟中毒對心肌損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

氟化鈉(分析純,北京化工廠生產(chǎn));6511型心電圖機(日本光電公司產(chǎn)品);原位細胞凋亡檢測試劑盒(武漢華美生物工程公司)。PE-P53及相應(yīng)同型對照均由Phar Mingen公司提供;破膜劑IntraPrep由美國貝克曼庫爾特公司提供。FACScan型流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司,BX-50型)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與實驗處理

選取40只3~4周齡健康雄性Wistar大鼠(由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,按自然晝夜節(jié)律采光,室溫20~25℃,普通飼料喂養(yǎng)),隨機分為氟化鈉25、50、100、150 mg·L-14個實驗組和一個對照組,實驗組每日飲用含不同氟化鈉濃度的蒸餾水,對照組飲用正常蒸餾水(n=8,分籠飼養(yǎng)),復(fù)制慢性氟中毒大鼠動物模型。大鼠實驗期為6個月。實驗開始和6個月時各描記心電圖一次,實驗期結(jié)束后處死各組大鼠,切取心肌組織,一部分心肌稱重后浸于4%多聚甲醛溶液固定18 h左右,石蠟包埋;另一部分置入液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存,備后期實驗用。

1.2.2 心電圖記錄

經(jīng)大鼠腹腔注射20%的烏拉坦0.5 m L·kg-1麻醉后,仰臥位固定于恒溫控制操作臺上,應(yīng)用心電圖機描記I,II,III標準導(dǎo)聯(lián)。標準電壓為1 m V= 20 mm,走紙速度為50 mm· s-1。導(dǎo)聯(lián)連接采用5 cm長針炙針刺入四肢,鱷魚夾連接導(dǎo)線。觀察指標為心率、T波電壓、Q-T間期。實驗在室溫為20 ~25℃的條件下進行。實驗開始時心電圖首次描記:Q-T間期、T波電壓以及心率各組比較均無差異(P>0.05)。

1.2.3 凋亡細胞原位標記(TUNEL)及凋亡細胞半定量分析

取心肌組織切片采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)d UTP的缺口末端標記法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL),常規(guī)脫蠟入水,經(jīng)30 m L·L-1H2O2處理、蛋白酶K消化后,加入TDT和Dig·d UTP 4℃過夜,封閉后加生物素化抗地高辛抗體,洗滌,加SABC,DAB顯色。光鏡下觀察陽性標記的細胞數(shù),陽性標記的凋亡細胞核呈棕褐色,陰性者細胞核呈藍色。在計算機圖像分析儀上,于陽性表達分布區(qū)域在光鏡400倍視野下,每張切片隨機拍攝5個無重疊陽性視野,每個視野計數(shù)200個細胞核,計數(shù)陽性細胞(凋亡細胞)和總細胞,凋亡指數(shù)(Apoptosis index,AI)=凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4 流式細胞術(shù)及p53基因蛋白表達的定量分析

將新鮮心肌組織用機械剪碎法制成單細胞懸液,用400目篩網(wǎng)過濾,再低速離心去除細胞碎片,70%冰冷乙醇固定,放4℃冰箱備檢。檢測前先用PBS洗滌細胞,再用PBS調(diào)整細胞濃度為1×l06·ml-1;細胞用破膜劑打孔后,加PE-p53抗體標記,并設(shè)同型陰性對照;經(jīng)離心洗滌后加500μl PBS液懸浮細胞,上機檢測,每次檢測10000個細胞。以對數(shù)方式采集數(shù)據(jù),以熒光指數(shù)(Fluorescence index,FI)表示它們的相對含量,計算公式為:熒光指數(shù)FI=(實驗樣品蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/(對照樣品蛋白表達的平均熒光強度)。

1.2.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)以X±SD表示,多個樣本均數(shù)間的比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析(One-way ANOVA);如果差異有統(tǒng)計學(xué)意義,再進行組內(nèi)兩兩比較,采用SNK-q檢驗(Student-Newman-Keuls法), P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 氟化鈉對大鼠心電圖的影響

如表1所示,不同濃度氟化鈉引起Q-T間期發(fā)生變化。T波電壓各組相比無差異(P>0.05)。氟化鈉25 mg·L-1組和50 mg·L-1組氟中毒大鼠Q-T間期與對照組相比無差異(q25-0=0.6346,P>0.05;q50-0=0.6129,P>0.05),氟化鈉100 mg·L-1組和150 mg·L-1組氟中毒大鼠Q-T間期與對照組相比明顯縮短(q100-0=4.7449,P<0.05;q150-0=5.2136, P<0.01),氟化鈉25 mg·L-1組與150 mg·L-1組相比則有顯著差異(q100-25= 4.1103,P < 0.01;q100-50= 4.1319, P<0.05;q150-25=4.579,P<0.01,q150-50=4.6007,P<0.05),氟化鈉25 mg·L-1組與50 mg·L-1組相比無差異(q25-50= 0.0216,P>0.05),氟化鈉100 mg·L-1組與150 mg·L-1組比較無差異(q100-150=0.4687,P>0.05)。心率各組比較均無差異(P>0.05)。

表1　氟對Wistar大鼠心電圖的影響(±SD,n=8)

表1　氟對Wistar大鼠心電圖的影響(±SD,n=8)

注:與對照組相比,*P<0.05。

組別(NaF,mg·L-1)心率(次·分-1) T波電壓(MV×10-2) Q-T間期(MS) 0(對照組)　 321.01±57.16　 29.71±10.99 97.13±4.36 25　327.78±64.28　 30.02±5.69 96.25±4.93 50　329.76±45.96　 29.38±8.63 96.28±4.70 100　355.22±76.71　 24.15±9.60 90.55±2.72*150　315.27±63.99　 24.17±7.64 89.90±2.03*

2.2 心肌細胞AI及各組比較

TUNEL標記的凋亡陽性細胞胞核呈棕褐色。如表2所示,對照組、氟化鈉25 mg·L-1組未見凋亡細胞,氟化鈉50 mg·L-1組、100 mg·L-1組和150 mg·L-1組細胞凋亡指數(shù)(AI)分別為3.21%±0.40%,16.56%±1.12%, 56.43%±1.96%,顯著高于對照組(P<0.01)。

表2　五組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)和p53表達比較(±SD,n=8)

表2　五組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)和p53表達比較(±SD,n=8)

注:(1)與對照組、氟化鈉25 mg·L-1組比較,★P<0.01;與氟化鈉50 mg· L-1組比較,▲P<0.01;與氟化鈉100 mg·L-1組比較,■P<0.05;(2)與對照組比較,*P<0.01;與氟化鈉100 mg·L-1組比較,△P<0.01。

組別(NaF,mg·L-1)　　凋亡指數(shù)(AI)(%) 　p53表達0(對照組)　0　3.35±0.21 25　0　3.46±0.29 50　3.21±0.40★　3.51±0.32 100　16.56±1.12★▲　5.91±0.42*150　56.43±1.96★▲■　6.40±0.47△

2.3 p53蛋白表達的比較

如表2所示,氟化鈉100 mg·L-1組和150 mg·L-1組p53蛋白表達顯著高于對照組(P < 0.01)。氟化鈉150 mg·L-1組p53蛋白表達顯著高于100 mg·L-1組(P< 0.01)。氟化鈉25 mg·L-1組和50 mg·L-1組p53蛋白表達與對照組比較無明顯變化(P>0.05)。

3 討論

氟對心臟的影響主要表現(xiàn)在心電圖、心肌收縮力及心肌形態(tài)等方面的改變,其中心電圖是反映心臟功能性和器質(zhì)性改變較敏感的指標。本實驗中心電圖結(jié)果顯示:氟化鈉100 mg· L-1和150 mg·L-1組大鼠Q-T間期與對照組比較明顯縮短,這與楊曉霞等[6]實驗結(jié)論相一致。細胞在發(fā)生凋亡時,會激活一些DNA內(nèi)切酶,這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時,暴露的3’-OH可以在末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上DIG標記的d UTP,從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測凋亡的細胞。本實驗中末端標記法檢測結(jié)果顯示:對照組、氟化鈉25 mg·L-1組未見凋亡的心肌細胞,氟化鈉50 mg·L-1組少見凋亡細胞,而100 mg·L-1組和150 mg·L-1組凋亡細胞明顯增多,上述結(jié)果說明細胞凋亡參與氟化鈉導(dǎo)致心肌損傷過程。

1979年LINZER等在DNA病毒SV40轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)了一種與SV40大T抗原結(jié)合的蛋白,因其分子量為53 kd而命名為P53。正常機體表達的是野生型P53(wtP53),對細胞生長具有負面調(diào)節(jié)作用;當機體組織細胞受到外來刺激時,可發(fā)生基因突變而變成突變型P53(mtP53),其功能與wtP53相反。P53可調(diào)節(jié)多種基因(如p21,c-myc,bcl-2,IL-2, fas和bax等)的表達,對細胞的增殖分化具有重要影響[7];同時P53是細胞應(yīng)激的關(guān)鍵性調(diào)控分子之一,通過轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄途徑對細胞危急事件信號做出包括細胞生長抑制或凋亡在內(nèi)的不同反應(yīng),因而一直是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。氟化鈉所致的心肌細胞凋亡與其他類型細胞凋亡一樣,可能受到許多細胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控,這其中包括p53。本次實驗對P53蛋白表達的測定結(jié)果顯示氟化鈉100 mg·L-1組和150 mg·L-1組P53蛋白表達顯著高于對照組,氟化鈉25 mg·L-1組和50 mg·L-1組p53蛋白表達與對照組比較無明顯變化,與褚啟龍等[8]實驗研究所表明的p53具有引起細胞凋亡作用相一致。凋亡率高者p53表達也相應(yīng)增高,提示p53基因上調(diào),依賴p53基因的凋亡通路在氟中毒對心肌損傷的機制中起到重要作用。當然,氟具體通過何種機制調(diào)節(jié)p53蛋白表達有待進一步研究加以證實。

參考文獻

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Effects of exposure of rats to fluoride on myocardial apoptosis and the expression of p53*

Wu Qi-qing1,Shen Yue-liang2,Liu Kai-tai3,Zhong Jin-jie2△
(1.Yongzhou Vocational Technical College,Hunan Yongzhou 425100; 2.Preclinical College,Xinjiang Medical University,Xinjiang Urumqi 830054; 3.National Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102200)

Abstract Objective:To study the effects of exposure of rats to fluoride on myocardial apoptosis and its mechanism.Methods: Forty 3~4-week-old male Wistar rats were randomly divided into 4 experimental groups:25,50,100,150 mg·L-1sodium fluoride (NaF)group and control group.All the experimental groups were fed with distilled water containing different concentrations of NaF respectively,and the control group with normal distilled water in order to duplicate the animal model of drinking water type fluorosis. Electrocardiogram(ECG)was taken before and after experiment for 6 months to observe ECG of the rats with fluorosis.Apoptotic cardiomyocytes were detected with TUNEL and the protein expression of p53 in cardiomyocytes was determined by the techniques of flow cytometry.Results:(1)As compared with control group,the Q-T interval in 100 mg·L-1group and 150 mg·L-1group were markedly shorter(P<0.05).(2)As compared with control group,the apoptosis rate of cardiomyocytes in 100 mg·L-1group and 150 mg·L-1group were significantly increased(P<0.01),accompanied with an increased expression of p53(P<0.01).Conclusion: Fluorosis can induce myocardial apoptosis,p53 may be involved in the regulation of the apoptotic process.

Key Words:Fluoride;Cardiomyocyte;Apoptosis;p53 gene

(收稿日期：2015-8-10)

通訊作者:△鐘近潔,女,教授,主要從事環(huán)境與健康研究,Email: zhongjinjie@gmail.com。

作者簡介:吳起清,男,講師,主要從事心血管生理學(xué)研究,Email: 754777550@qq.com。

*基金項目:國家自然科學(xué)基金資助(編號:30860249)