淮南麻黃雞MHCⅠα鏈基因的克隆及序列分析

戴 銀，王承志，沈?qū)W懷，趙瑞宏， 胡曉苗，侯宏艷，潘孝成，周學(xué)利，張丹俊*

(1.安徽省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

淮南麻黃雞MHCⅠα鏈基因的克隆及序列分析

戴 銀1，王承志2，沈?qū)W懷1，趙瑞宏1， 胡曉苗1，侯宏艷1，潘孝成1，周學(xué)利1，張丹俊1*

(1.安徽省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

典型的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是抗原遞呈的關(guān)鍵分子，具有重要的免疫功能，與多種疾病密切相關(guān)。為深入了解地方品種雞MHCⅠ類α分子的特征，尤其是抗原結(jié)合區(qū)域的特點(diǎn)，通過RT-PCR技術(shù)獲得了29個(gè)淮南麻黃雞完整的α鏈基因，并進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，淮南麻黃雞MHCⅠα分子高度多態(tài)，但主要集中在α1和α2區(qū)域，該區(qū)變異氨基酸位點(diǎn)共68個(gè)，其中高度變異22個(gè)?；茨下辄S雞MHCⅠ分子α1和α2區(qū)域氨基酸序列同源性介于79.3%～99.5%之間，僅少部分序列完全一致。雞氨基酸序列同源性與鴨較高，介于57.6%～64.1%之間；其次為人和鼠。進(jìn)化分析顯示，淮南麻黃雞MHCⅠ分子α1和α2區(qū)域分屬于兩個(gè)類群，但未顯示明顯的品種差異。此外，雞與鴨的親緣關(guān)系較近，與其他物種則遺傳距離較遠(yuǎn)。研究結(jié)果表明，淮南麻黃雞MHC分子在進(jìn)化過程中呈現(xiàn)高度的多態(tài)性，但受到病原體的選擇壓力，多態(tài)性主要位于抗原肽結(jié)合部分的α1和α2區(qū)域。

MHCⅠ類分子；序列分析；淮南麻黃雞

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)具有辨別自身與非己的獨(dú)特功能，同時(shí)又直接參與抵抗病原體入侵及自身穩(wěn)定的過程，因而在脊椎動(dòng)物進(jìn)化中扮演著不可替代的重要角色[1-2]。由于MHC的表達(dá)產(chǎn)物廣泛參與各種抗原的識別，其遺傳背景的差異可導(dǎo)致不同個(gè)體抗病能力及自身免疫疾病易感性的差異，目前已證實(shí)，MHC與人類和動(dòng)物的多種疾病之間相關(guān)[3-5]。由于MHC突出的特性和其在免疫遺傳學(xué)和群體遺傳學(xué)領(lǐng)域中的重要作用，已被作為抗病育種遺傳標(biāo)記輔助選擇的重要位點(diǎn)[6-8]。另外，有報(bào)道表明，MHC除了與某些疾病密切有關(guān)，而且還與畜禽的繁殖性能、生長性能及肉質(zhì)都存在一定的相關(guān)性，因此充分研究MHC的特性，并利用該基因培育出高產(chǎn)、抗病力強(qiáng)的家畜品種極具發(fā)展?jié)摿9-10]。MHCⅠ類分子是一種膜結(jié)合糖蛋白，由重鏈(α)和輕鏈(β2m)微球蛋白兩部分以非共價(jià)鍵結(jié)合組成。成熟的α鏈由3個(gè)胞外區(qū)域(α1、α2、α3)及轉(zhuǎn)膜區(qū)域和胞質(zhì)尾區(qū)組成，其中α1和α2區(qū)是MHCⅠ類分子抗原多態(tài)性的分子基礎(chǔ)，多態(tài)性主要體現(xiàn)在該區(qū)?？乖嚯慕Y(jié)合區(qū)位于α1和α2區(qū)域，可與病毒、腫瘤細(xì)胞等內(nèi)源性抗原多肽結(jié)合，并將其遞呈給CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞性免疫應(yīng)答。我國優(yōu)良的地方雞品種較多，各有優(yōu)勢，然而目前仍然沒有一個(gè)完善的保持和改進(jìn)品質(zhì)的培育系統(tǒng)，MHCⅠ作為抗病育種的關(guān)鍵基因之一，僅少數(shù)幾個(gè)國內(nèi)外雞品種有相關(guān)報(bào)道；同時(shí)家畜禽在飼養(yǎng)過程中主要受人工干預(yù)和傳染病原侵?jǐn)_，與在自由環(huán)境中的生物有所不同，那么MHC基因的進(jìn)化特點(diǎn)是否也有所差異。為此，克隆安徽省地方品種淮南麻黃雞MHCⅠ分子的cDNA基因，并分析其分子特征，尤其是α1和α2區(qū)域的遺傳特點(diǎn)，初步探索MHCⅠ分子與疾病之間的關(guān)系，為下一步分子育種及制備基因工程疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)雞為安徽省地方品種淮南麻黃雞，35只，210日齡，來源于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸埃希菌BL21和載體pMD18-T為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 工具酶和試劑 DNA Marker DL 2 000、T4連接酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；dNTP、Taq酶、瓊脂糖(電泳純)為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；DNA清潔/PCR產(chǎn)物清潔試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒為杭州維特潔生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；第一鏈合成試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 經(jīng)Oligo 6.0軟件分析，參照GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的雞MHCⅠα序列(GenBank 登錄號：S78682)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物：上游引物P-α-F：5′-GAGAGTGCAGCGGTGCGAGGCGAT-3′；下游引物P-α-R：5′-AATGCTGGTGTGGACTGTTGGCTC-3′。上、下游引物之間跨幅分別約為1 136 bp，涵蓋了編碼雞MHCⅠα完整閱讀框。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，使用前用滅菌ddH2O稀釋至20 pmol/L。

1.2.2 RNA提取和cDNA的合成 通過雞外周靜脈采血，每5 mL血液中加入1 mL抗凝劑，4 ℃儲存?zhèn)溆?。使用Trizol試劑抽提雞血液中總RNA。以提取的總RNA為模板合成cDNA，具體方法參照寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品cDNA第一鏈合成試劑盒使用說明書。

1.2.3 MHCⅠα基因的擴(kuò)增 以cDNA第1鏈為

模板，以P-α-F、P-α-R為上、下游引物，擴(kuò)增MHCⅠα基因。PCR反應(yīng)體系：10× PCR buffer 5.0 μL,dNTP Mixture 3.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)足60 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，67 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 基因序列分析 使用Clustal X 1.83軟件比對序列，DNA Star、MegAlign等軟件分析序列同源性。使用MEGA3.1軟件，Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。來航雞、烏雞、珍珠雞、鴨、人和鼠的相應(yīng)序列均來自GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為AY989897、AB178042、AB178051、AB115242、NM-002116 和 NM-010380。

2 結(jié)果

2.1 淮南麻黃雞MHCⅠα基因的擴(kuò)增

獲得的總RNA經(jīng)紫外分光法分析，純度達(dá)到了下一步試驗(yàn)的要求。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到MHCⅠα基因的第一鏈，隨即進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到29個(gè)約1 136 bp的MHCⅠα特異性條帶，與預(yù)期的片段長度一致，陰性對照組未見特異性條帶(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； N.陰性對照; 1～29. MHCⅠα PCR產(chǎn)物
M. DNA Marker DL 2 000; N. Negative control; 1-29. PCR products of MHCⅠα gene

圖1 MHCⅠα 基因的RT-PCR結(jié)果
Fig.1 RT-PCR results of MHC Ⅰ α gene

2.2 MHCⅠα氨基酸序列分析

克隆了29條淮南麻黃雞MHCⅠα鏈cDNA全長基因，獲得了1 035 bp和1 068 bp兩種長度的序列，分別由7或8個(gè)外顯子組成。推導(dǎo)的氨基酸序列顯示1 068 bp編碼355個(gè)氨基酸，1 035 bp編碼344個(gè)氨基酸。各外顯子分別對應(yīng)21個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)肽，88個(gè)殘基的α1區(qū)域，91個(gè)殘基的α2 區(qū)域，91個(gè)殘基的α3區(qū)域，53或64個(gè)殘基的TM/CY區(qū)域。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)較多，但主要集中于α1和α2區(qū)域。進(jìn)一步分析可見，α1和α2區(qū)域共68個(gè)可變位點(diǎn)，占α1和α2區(qū)域的36.3%。其中第2、8、9、24、43、66、68、72、73、75、76、82、97、111、113、121、128、147、148、149、153和155位為高變異位點(diǎn)(圖2)。

2.3 α1和α2區(qū)域氨基酸序列同源性分析

同源性分析可見，淮南麻黃雞品種內(nèi)存在少數(shù)一致序列，其余22條雞的MHCⅠα1和α2區(qū)域氨基酸序列同源性介于79.3%～99.5%之間?；茨下辄S雞與來航雞同源性介于79.3%～90.8%之間，與烏雞同源性介于82.6%～94%之間，與珍珠雞同源性介于82.1%～92.9%之間。同時(shí)雞與鴨、人和鼠的MHCⅠα序列比對可見，雞與鴨序列相似性介于57.6%～64.1%之間，而與鼠的序列相似性在44.0%～48.9%之間，與人的序列相似性在44.6%～49.5%之間(圖3)。

2.4 α1和α2區(qū)域氨基酸序列進(jìn)化分析

將所有MHCⅠα基因 α1和α2區(qū)域氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，可見淮南麻黃雞MHCⅠα氨基酸序列沒有單獨(dú)聚集為一類，被歸屬于兩個(gè)類群，第一類群較大，且繼續(xù)進(jìn)化為不同分支，而第二類群僅含有2條序列。同時(shí)來航雞、烏雞和珍珠雞的序列均屬于第一大類群。此外，可見雞與鴨的MHCⅠα親緣關(guān)系較近，而雞與人、鼠的MHCⅠα氨基酸序列遺傳距離則較遠(yuǎn)。

序列上方的數(shù)字代表氨基酸殘基的位置; 一致的氨基酸用點(diǎn)表示; 短線表示缺失的氨基酸殘基

The numbers above the sequences represent amino acid positions. Dots represent identity in amino acid residues. Dashes represent the amino acid deletion

圖2 MHCⅠα鏈 α1和α2區(qū)域比對
Fig.2 Alignment of α1and α2 domains of MHC class Ⅰα

圖3 MHCⅠα鏈α1和α2區(qū)域同源性比對Fig.3 The homology comparison of α1and α2 domains of MHC class Ⅰα

遺傳距離在圖的下方；聚類分析的可靠性用bootstrap置信區(qū)限檢測

Genetic distance is indicated at the bottom; The reliability of the cluster analyses are tested by bootstrap confidence limits

圖4 MHCⅠα鏈α1和α2區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.4 Phylogenetic tree of α1and α2 domains of MHC class Ⅰ α

3 討論

共克隆了29條淮南麻黃雞MHCⅠ序列，經(jīng)分析除了少數(shù)序列完全一致外，其余大部分序列呈現(xiàn)多態(tài)性。此外，我們發(fā)現(xiàn)多態(tài)的氨基酸位點(diǎn)主要聚集于α1和α2區(qū)域共有68個(gè)變異位點(diǎn)，其中22個(gè)高度變異。α1和α2區(qū)域?yàn)榭乖f呈的關(guān)鍵位置，其在分子內(nèi)形成與抗原肽結(jié)合的分子凹槽，該區(qū)域部分位點(diǎn)與抗原肽識別密切相關(guān)。Furlong R F等[11]分析了哺乳動(dòng)物的MHCⅡ類分子DRB，其處于正選擇的多態(tài)性氨基酸位點(diǎn)幾乎都在PBR區(qū)，與抗原側(cè)鏈相接觸，或緊靠PBR。Hinrichs J等[3]模擬了人類兩個(gè)HLA-A*30等位基因的同源模型，雖然兩個(gè)結(jié)構(gòu)外在是一致的，但Cys164Ser的多態(tài)性改變了其與抗原的結(jié)合力，導(dǎo)致部分抗原肽不能被有效遞呈，這種效果會對移植產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。這說明MHC分子的PBR區(qū)域較為多態(tài)，部分位點(diǎn)的高度變異，可能更有利于與各類不同抗原肽結(jié)合。

MHC等位基因來源于共同祖先，優(yōu)勢基因型似乎與環(huán)境壓力，特別是疾病的選擇有關(guān)，而不受區(qū)域與品種差異影響。研究結(jié)果也顯示雞MHCⅠ序列α1和α2區(qū)域，同源性介于79.3%～100%之間，部分序列差異較大，但進(jìn)化分析顯示品種內(nèi)和品種間差異不顯著，不同來源雞MHCⅠ分子均來自共同祖先。Gu X等[12]研究發(fā)現(xiàn)MHC基因受制于頻繁的基因變異，哺乳動(dòng)物MHC進(jìn)化是與生和死演化模式一致的，而不是協(xié)同演化模式。在養(yǎng)殖條件下，傳染病病原的威脅壓力是生死選擇，所以，MHC基因是動(dòng)物在適應(yīng)過程，尤其是其受到病原體介導(dǎo)的選擇[13-14]。因此，不同的雞品種外形和生產(chǎn)性能上有很大區(qū)別，但是在基本相同環(huán)境壓力下抵御病原的進(jìn)化過程中，MHC分子仍然保持著共同祖先的遺傳特征[15]。本研究初步分析了地方品種淮南麻黃雞MHCⅠ類α分子的特征，尤其是抗原結(jié)合區(qū)域的遺傳特點(diǎn)，為下一步研究更多長期馴化的不同地方雞品種MHC分子結(jié)構(gòu)特征，及其與抗病性關(guān)系的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of MHC ClassⅠα Gene in Huainan Partridge Chickens

DAI Yin1,WANG Cheng-zhi2,SHEN Xue-huai1,ZHAO Rui-hong1,HU Xiao-miao1,HOU Hong-yan1,PAN Xiao-cheng1,ZHOU Xue-li1,ZHANG Dan-jun1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,Hefei,Anhui,230031,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui,230036,China)

Typical major histocompatibility complex (MHC) is the key of antigen-presenting molecules, plays a crucial role in the immune system, and closely relates to many diseases. In order to further understand molecular characteristics of chicken MHC Class Ⅰ gene, and peptide-binding regions, the 29 chicken MHC Ⅰα genes from Huainai partridge chicken were cloned by RT-PCR. The results revealed that MHC gene was highly polymorphic,but they were mainly located in the α1 and α2 regions.There were 68 mutations, which were distributed in the α1 and α2 regions, but 22 of them were highly mutated sites. The amino acid homology among α1 and α2 regions of chicken MHCⅠranged from79.3% to 99.5%%, only several sequences were identical.The results showed that α1 and α2 regions of chicken MHCⅠ shared higher amino acid homology with that of duck, between 57.6%-64.1%, and followed by human and mouse. In the phylogenetic tree,all amino acid sequences of α1 and α2 regions from chickens belonged to two clusters together, no correlation with the chicken breeds. Chicken had a closer genetic relationship with duck, and the genetic distance of other species was farther. The results showed that chicken MHCⅠ molecules showed high polymorphism in the evolutionary process, but the polymorphism located mainly in peptide-binding region of α 1 and α 2 under pressure of the pathogen.

MHC class Ⅰ;sequence analysis;Huainan partridge chicken

2014-06-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302044)；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-41)；安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)肉禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金；院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(11C0404)

戴 銀(1980-)，女，安徽蒙城人，助理研究員，博士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。*

S858.31;Q785

:A

:1007-5038(2015)02-0034-05