HPLC法測定槲寄生中N-桂皮?；《?/h1>
2015-03-10 01:35:31孫永慧
孫永慧，郎 悅，張 穎
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040)
HPLC法測定槲寄生中N-桂皮酰基丁二胺
孫永慧，郎 悅，張 穎
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040)
建立HPLC法測定槲寄生中N-桂皮?；《返牧康姆椒?采用高效液相色譜法檢測，DiamonsilTMC18色譜柱(5.6×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.2%磷酸溶液(20∶80)為流動相；檢測波長：278 nm；流速：1.0mL/min；柱溫：25 ℃. N-桂皮?；《吩?.1～0.5 μg(r=0.999 8)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；平均回收率為98.3%(n=6)，RSD=0.8%.該測定方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可作為該藥材的質(zhì)量控制方法.
槲寄生；N-桂皮?；《罚桓咝б合嗌V
槲寄生是桑寄生科槲寄生屬植物，主要含有黃酮、三萜、生物堿等成分.具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎、安胎元的功效，用于風(fēng)濕痹痛，筋骨無力，崩漏經(jīng)多，妊娠漏血，腰膝酸軟，胎動不安，頭暈?zāi)垦５劝Y[1].據(jù)文獻(xiàn)報道，槲寄生屬植物具有抗心律失常、抗病毒、抗氧化等多種作用[2]，槲寄生生物堿抗腫瘤活性很強(qiáng)[3].本實驗測定了槲寄生中生物堿類成分N-桂皮酰基丁二胺的量[4-5]，為評價槲寄生質(zhì)量提供了參考.
1 儀器與試藥
Waters 2695-2998型高效液相色譜儀(美國沃特斯公司)；CPA225D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司).槲寄生(哈爾濱順合大藥房有限公司)；N-桂皮?；《?從槲寄生中分離得到，經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC歸一化法測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98.0%以上)；乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；其他試劑(分析純).
2 方法及結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱型號：DiamonsilTMC18(5μm，5.6×250 mm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液(20∶80)；檢測波長是278 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫是25 ℃.HPLC色譜圖見圖1、2.
圖1 N-桂皮?；《穼φ掌稨PLC圖
圖2 槲寄生藥材HPLC圖
2.2 制備供試品溶液
取干燥的槲寄生藥材粗粉5 g，用分析天平精密稱定質(zhì)量，用75%的乙醇溶液50 mL回流提取2 h，濾過，取濾液，濃縮提取液至無醇味，然后加入水15 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，濾過，取濾液，用濃氨水調(diào)pH值至9～10，再用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，用色譜甲醇定容至5 mL的量瓶中，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，得到待測供試品溶液.
2.3 制備對照品溶液
稱取自制的N-桂皮?；《穼φ掌?.5 mg，精密稱定重量，置于50 mL容量瓶中，精密加甲醇至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的N-
桂皮酰基丁二胺對照品溶液.
2.4 測定線性范圍及制備標(biāo)準(zhǔn)曲線
分別精密吸取N-桂皮?；《穼φ掌啡芤?、4、6、8、10、12 μL，按前述2.1項下的色譜條件，注入液相色譜儀中，進(jìn)行色譜峰面積測定，將測得的對照品色譜峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以對照品色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程是：Y=2.2×106X-10 789(r=0.999 8)，上述結(jié)果顯示：N-桂皮?；《穼φ掌愤M(jìn)樣量在0.1～0.6 μg之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.
2.5 精密度試驗
分別精密吸取N-桂皮?；《穼φ掌啡芤?0 μL，按照前述2.1項下的色譜條件，進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄對照品峰面積，結(jié)果峰面積值的RSD為1.6 %，結(jié)果說明儀器精密度較高，測定結(jié)果可靠.
2.6 穩(wěn)定性試驗
取前述2.2項下制備的槲寄生供試品溶液，按照設(shè)定的時間間隔分別進(jìn)樣測定.時間間隔如下：0、2、4、6、8、12 h.按照前述2.1項下的色譜條件，進(jìn)樣測定，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果顯示，槲寄生供試品溶液在12 h之內(nèi)是穩(wěn)定的，RSD為1.7%.
2.7 重復(fù)性試驗
取槲寄生藥材粉末6份，每份大約5 g，精密稱定質(zhì)量，按前述2.2項下方法提取制備槲寄生供試品溶液并進(jìn)行測定，計算6批供試品中N-桂皮酰基丁二胺的量，結(jié)果N-桂皮?；《返牧科骄禐?.062 5 mg/g，RSD為1.5%.試驗結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好.
2.8 加樣回收率試驗
取槲寄生藥材粉末6份，每份大約2.5 g，精密稱定重量，每份供試品分別加入N-桂皮?；《穼φ掌?.15 mg(精密加入配制的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對照溶液1.50 mL)，按照前述2.2項下供試品溶液制備方法制得待測加樣回收率的樣品溶液，注入液相色譜儀，依前述2.1項下色譜條件法進(jìn)樣檢測，檢測結(jié)果見表1.測定結(jié)果表明，該測定方法回收率較好，測定結(jié)果可靠.
表1 加樣回收率測定結(jié)果
取樣量/g樣品中的量/mg對照品加入量/mg測得量/mg回收率/%回收率平均值/%RSD/%2．50590．15660．15000．305699．32．51060．15690．15000．304598．42．49260．15580．15000．304499．12．50070．15630．15000．301997．12．50820．15680．15000．303898．02．51910．15740．15000．304197．898．30．8
2.9 樣品測定
取6批槲寄生藥材，分別粉成細(xì)粉，按前述2.2項下方法制備槲寄生供試品溶液，分別精密吸取前述2.3項下的對照品溶液與槲寄生藥材供試品溶液各10 μL，按照前述2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2.
表2 槲寄生藥材測定結(jié)果
批號取樣量/gN-桂皮酰基丁二胺的量/(mg·g-1)平均值/(mg·g-1)RSD/%201309015．05840．0659201309025．03360．0615201309034．94200．0641201309045．06110．0628201309054．99710．0631201309065．10740．06030．06252．4
3 討 論
本實驗采用了高效液相色譜法進(jìn)行了N-桂皮?；《返牧繙y定，由于槲寄生生物堿類成分復(fù)雜，高效液相色譜測定干擾較多，因此本實驗采用酸溶堿沉有機(jī)溶劑提取法提取純化槲寄生總生物堿.
經(jīng)紫外掃描N-桂皮?；《吩?78 nm有最大吸收且干擾最小，因此本實驗測定波長確定為278 nm.實驗中發(fā)現(xiàn)磷酸溶液的酸度及用量對分離效果有較大影響，以乙腈-0.2%磷酸水為流動相，流動相比例為20∶80時，色譜峰分離效果較好，峰形及相鄰峰分離良好.
采用HPLC測定槲寄生藥材中N-桂皮酰基丁二胺的量，對于評價槲寄生的質(zhì)量具有較大意義，為槲寄生生物堿類的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù).
[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010. 348.
[2] 張水仙,劉 越,孫洪波,等.槲寄生化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材, 2011, 34(12): 1962-1967.
[3] 彭海燕, 章永紅, 韓 英, 等. 槲寄生堿抗腫瘤作用的研究[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(5): 381-382.
[4] 孫永慧, 凌 勇, 張 嵩, 等. 不同寄主紅果槲寄生中總生物堿的含量測定[J]. 中醫(yī)藥信息, 2009, 26(3): 15-16.
[5] 孫永慧, 凌 勇, 任美榮, 等. 紅果槲寄生的化學(xué)成分研究[J].中草藥, 2010, 41(9): 1418- 1420.
Determination of N-cinnamoyl putrescine in Viscum coloratum (Kom.) Nakai by HPLC
SUN Yong-hui, LANG Yue, ZHANG Ying
(Academy of Chinese Medicine, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China)
An assay method was established for the determination of N-cinnamoyl putrescine in Viscum coloratum (Kom.) Nakai by HPLC. DiamonsilTMC18analytical column (250 mm×5.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of aceronitrile-0.2% H3PO4(20∶80). The flow rate was 1.0 mL/min. The detecting wavelength was at 278 nm. The column temperature was at 25 ℃. The linear range of N-cinnamoyl putrescine was 0.1～0.5 μg (r=0.999 8).The average recovery was 99.9%.RSD=1.80%. The method was accurate, simple, highly sensitive and reproducible. It can be used for the quality control of Visum coloratum (Kom.) Nakai.
Viscum coloratum (Kom.) Nakai; N-cinnamoyl putrescine; HPLC
2014-12-07.
黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12531635)
孫永慧(1974-)，女，博士，副研究員，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.
R284
A
1672-0946(2015)05-0530-03
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2 方法及結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱型號：DiamonsilTMC18(5μm，5.6×250 mm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液(20∶80)；檢測波長是278 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫是25 ℃.HPLC色譜圖見圖1、2.
圖1 N-桂皮?；《穼φ掌稨PLC圖
圖2 槲寄生藥材HPLC圖
2.2 制備供試品溶液
取干燥的槲寄生藥材粗粉5 g，用分析天平精密稱定質(zhì)量，用75%的乙醇溶液50 mL回流提取2 h，濾過，取濾液，濃縮提取液至無醇味，然后加入水15 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，濾過，取濾液，用濃氨水調(diào)pH值至9～10，再用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，用色譜甲醇定容至5 mL的量瓶中，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，得到待測供試品溶液.
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2.5 精密度試驗
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2.8 加樣回收率試驗
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表1 加樣回收率測定結(jié)果
取樣量/g樣品中的量/mg對照品加入量/mg測得量/mg回收率/%回收率平均值/%RSD/%2．50590．15660．15000．305699．32．51060．15690．15000．304598．42．49260．15580．15000．304499．12．50070．15630．15000．301997．12．50820．15680．15000．303898．02．51910．15740．15000．304197．898．30．8
2.9 樣品測定
取6批槲寄生藥材，分別粉成細(xì)粉，按前述2.2項下方法制備槲寄生供試品溶液，分別精密吸取前述2.3項下的對照品溶液與槲寄生藥材供試品溶液各10 μL，按照前述2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2.
表2 槲寄生藥材測定結(jié)果
批號取樣量/gN-桂皮酰基丁二胺的量/(mg·g-1)平均值/(mg·g-1)RSD/%201309015．05840．0659201309025．03360．0615201309034．94200．0641201309045．06110．0628201309054．99710．0631201309065．10740．06030．06252．4
3 討 論
本實驗采用了高效液相色譜法進(jìn)行了N-桂皮?；《返牧繙y定，由于槲寄生生物堿類成分復(fù)雜，高效液相色譜測定干擾較多，因此本實驗采用酸溶堿沉有機(jī)溶劑提取法提取純化槲寄生總生物堿.
經(jīng)紫外掃描N-桂皮?；《吩?78 nm有最大吸收且干擾最小，因此本實驗測定波長確定為278 nm.實驗中發(fā)現(xiàn)磷酸溶液的酸度及用量對分離效果有較大影響，以乙腈-0.2%磷酸水為流動相，流動相比例為20∶80時，色譜峰分離效果較好，峰形及相鄰峰分離良好.
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[2] 張水仙,劉 越,孫洪波,等.槲寄生化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材, 2011, 34(12): 1962-1967.
[3] 彭海燕, 章永紅, 韓 英, 等. 槲寄生堿抗腫瘤作用的研究[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(5): 381-382.
[4] 孫永慧, 凌 勇, 張 嵩, 等. 不同寄主紅果槲寄生中總生物堿的含量測定[J]. 中醫(yī)藥信息, 2009, 26(3): 15-16.
[5] 孫永慧, 凌 勇, 任美榮, 等. 紅果槲寄生的化學(xué)成分研究[J].中草藥, 2010, 41(9): 1418- 1420.
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SUN Yong-hui, LANG Yue, ZHANG Ying
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An assay method was established for the determination of N-cinnamoyl putrescine in Viscum coloratum (Kom.) Nakai by HPLC. DiamonsilTMC18analytical column (250 mm×5.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of aceronitrile-0.2% H3PO4(20∶80). The flow rate was 1.0 mL/min. The detecting wavelength was at 278 nm. The column temperature was at 25 ℃. The linear range of N-cinnamoyl putrescine was 0.1～0.5 μg (r=0.999 8).The average recovery was 99.9%.RSD=1.80%. The method was accurate, simple, highly sensitive and reproducible. It can be used for the quality control of Visum coloratum (Kom.) Nakai.
Viscum coloratum (Kom.) Nakai; N-cinnamoyl putrescine; HPLC
2014-12-07.
黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(12531635)
孫永慧(1974-)，女，博士，副研究員，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.
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1672-0946(2015)05-0530-03
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