芪丑湯拆方對(duì)ERS大鼠RIF分子伴侶作用的影響

張 翠，周艷巖，周亞潔，蘆 瑩，王丹楓

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 黑龍江省松花江藥業(yè)有限公司，哈爾濱 150056)

芪丑湯拆方對(duì)ERS大鼠RIF分子伴侶作用的影響

張 翠1，周艷巖1，周亞潔1，蘆 瑩2，王丹楓1

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；2. 黑龍江省松花江藥業(yè)有限公司，哈爾濱 150056)

研究芪丑湯拆方對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶作用的機(jī)理.通過(guò)單側(cè)輸尿管梗阻建立大鼠腎間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型.將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、依那普利組、芪丑湯全方組、溫補(bǔ)脾腎組、泄?jié)峄鼋M.分別于造模后第7天、第14天處死大鼠，收集大鼠血清測(cè)定肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)；摘取左側(cè)腎臟，稱(chēng)腎臟重量比較分析，觀察腎臟水腫程度；采用HE染色評(píng)定腎小管損傷指數(shù)，及腎間質(zhì)纖維化程度；采用Western Blot免疫印跡法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、GRP94蛋白表達(dá)水平.結(jié)果表明，術(shù)后第7、14天，各治療組與模型組比較，Scr、BUN的水平均明顯降低(P<0.01，P<0.05)；第7天芪丑湯全方組與依那普利組比較Scr水平有差異(P<0.05)；第14天芪丑湯全方組與依那普利組比較，降低Scr、BUN作用明顯(P<0.05)；術(shù)后第7、14天，除14天的溫補(bǔ)脾腎組外各治療組與模型組相比，均能減小腎重(P<0.01，P<0.05)；芪丑湯全方組與依那普利組比較能減輕腎重(P<0.05)；術(shù)后第7天芪丑湯全方組與模型組相比，能顯著減輕腎小管損傷(P<0.05)；14天芪丑湯全方組與依那普利組比較，腎小管損傷作用有差異(P<0.05)；術(shù)后第14天，芪丑湯全方組和泄?jié)峄鼋M與模型組比較GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)有顯著差異 (P<0.01)，與依那普利組比較，芪丑湯全方組能顯著抑制GRP78、GRP94的表達(dá)(P<0.01).芪丑湯全方組能夠保護(hù)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的腎功能；減輕腎臟腎盂積水；降低腎小管損傷指數(shù)；減少GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)從而干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，阻礙細(xì)胞凋亡沉積引起的腎間質(zhì)纖維化.各治療組14天的作用效果優(yōu)于7天，泄?jié)峄鼋M優(yōu)于溫補(bǔ)脾腎組.

芪丑湯；腎間質(zhì)纖維化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；GRP78；GRP94

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)患病率近年來(lái)持續(xù)增高， 各國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示為8%～15%之間，而知曉率偏低，少于10%[1].各種原因所致腎病都會(huì)經(jīng)過(guò)腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)這一病理表現(xiàn)，阻止腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展對(duì)防治CKD有重大意義[2].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腎間質(zhì)纖維化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)密切相關(guān)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已被證實(shí)廣泛參與到各種原因(缺血、缺氧等)引起的腎臟疾病中[3-5].內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulated protein，GRP94)可結(jié)合，協(xié)同發(fā)現(xiàn)和調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定.

芪丑湯具有溫補(bǔ)脾腎、泄?jié)峄龅墓δ?，用于治療小便不利，浮腫，畏寒肢冷，面色晦暗，惡心嘔吐，腹脹納呆，體倦乏力，舌淡暗胖苔白膩，脈沉遲無(wú)力.對(duì)腎間質(zhì)纖維化有治療作用[6].本研究是探討芪丑湯拆方對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)的干預(yù)作用，以及防治大鼠腎組織間質(zhì)纖維化的作用方面的研究，為防治慢性腎病提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

芪丑湯全方組(黃芪60 g、人參15 g、白術(shù)15 g、茯苓20 g、丹參20 g、陳皮10 g、水蛭15 g、附子15 g、大黃10 g、二丑20 g、砂仁15 g、石菖蒲15 g、王不留行15 g 半枝蓮20 g、蘆巴子20 g、甘草10 g)，由人民同泰藥店提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，體重(200±20) g，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004；肌酐試劑盒(苦味酸法)液體型：中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：122321；尿素測(cè)定試劑盒(酶偶聯(lián)速率法)干粉型：中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：120891；堿性磷酸酯酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG(H+L)，ZSGB-BIO，ZB-2310；堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，ZSGB-BIO，ZB-2308；Actin抗體，Beyotime，AA128；GRP78- BiP Antibody，CST，#3183；GRP94 Antibody，CST，#2104；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒：Beyotime，C3206

1.3 儀器

PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀：常州中威電子儀器廠；BM-Ⅶ水浴式生物組織包埋機(jī)：孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；YT-6C生物組織攤烤片機(jī)：湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所；KD-202C輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：上海之信儀器有限公司；Glamour 2000型全自動(dòng)生化分析儀：美國(guó)M.D.儀器公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽：BIO-RAD公司；半干轉(zhuǎn)印槽 Trans-Blot SD ：BIO-RAD公司

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物組成及煎制

芪丑湯全方組：黃芪60 g、人參15 g、白術(shù)15 g、茯苓20 g、丹參20 g、陳皮10 g、水蛭15 g、附子15 g、大黃10 g、二丑20 g、砂仁15 g、石菖蒲15 g、王不留行15 g、半枝蓮20 g、蘆巴子20 g、甘草10 g.

溫補(bǔ)脾腎組：黃芪60 g、附子15 g、人參15 g、蘆巴子20 g、白術(shù)15 g、茯苓20 g、甘草10 g.

泄?jié)峄鼋M：大黃10 g、二丑20 g、砂仁15 g、石菖蒲15 g、王不留行15 g、半枝蓮20 g、丹參20 g、水蛭15 g、陳皮10 g.

按照各藥在方中的比例準(zhǔn)確稱(chēng)取，混勻，加10倍水浸泡6 h，加熱煎煮1 h，濾出藥液.再加入8倍水，煎煮1 h，大黃后下，過(guò)濾，將兩次煎煮所得藥液混勻再減壓濃縮、過(guò)濾，得到每毫升藥液含2.66 g生藥量的液體，另兩個(gè)拆方組濃度按芪丑湯全方組方比例折算，即泄?jié)峄鼋M1.26 g/mL，溫補(bǔ)脾腎組1.40 g/mL.在4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將120只大鼠隨機(jī)分為以下6組，假手術(shù)組、模型組、依那普利組、芪丑湯全方組、溫補(bǔ)脾腎組、泄?jié)峄鼋M，每組各20只.假手術(shù)組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃；依那普利組給藥劑量為0.45 mg/kg/d[7]；前期研究結(jié)果顯示低劑量為好，因此芪丑湯全方組給藥劑量為13.35 g/kg/d，溫補(bǔ)脾腎組給藥劑量6.59 g/kg/d，泄?jié)峄鼋M給藥劑量為6.76 g/kg/d；各組于手術(shù)前一天開(kāi)始灌胃給藥，每日1次，共14 d.

2.3 建立UUO模型

本文采用單側(cè)輸尿管梗阻法(UUO)建立腎間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型.禁食24 h，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，常規(guī)消毒、去毛、無(wú)菌條件下從大鼠左肋脊角下方剪開(kāi)皮膚及肌層至腹膜后，用眼科鑷分離左側(cè)的輸尿管，在輸尿管的上下兩端處分別用手術(shù)線進(jìn)行結(jié)扎并從中間剪斷輸尿管，逐層縫合腹壁及皮膚.假手術(shù)組剝離輸尿管(但并不結(jié)扎和切斷輸尿管)后即縫合腹腔.

2.4 Scr、BUN檢定

分別于術(shù)后第7、14天采用摘眼球取血法取血，約3 mL，不抗凝，置普通試管中，血液收集后經(jīng)離心2 500 r/min，10 min分離出血清，將血清保存于-20 ℃冰箱，利用Glamour 2000型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行腎功能檢測(cè).

2.5 HE染色

采用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)對(duì)腎小管損傷指數(shù)進(jìn)行半定量分析.首先，對(duì)用石蠟包埋的腎組織進(jìn)行脫蠟處理，浸入蘇木素液中染色，經(jīng)鹽酸酒精分化脫色、氨水溶液中處理后，浸入伊紅水溶液復(fù)染，再進(jìn)行脫水，用蘸有中性樹(shù)脂的蓋玻片封片，最后放入干燥箱中2～3天.將HE染色組織切片放在400倍光鏡下并且每個(gè)切片隨機(jī)選擇10個(gè)不含腎小球的視野.

取適量組織加入細(xì)胞裂解液，用勻漿器研磨，12 000 r/min離心10 min，取上清分裝于0.5 mLEP管中保存.用BCA蛋白分析試劑盒對(duì)上樣蛋白含量測(cè)定；蛋白質(zhì)按照5∶1的比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，在沸水中煮5 min左右；配制12%分離膠和5%濃縮膠，按蛋白含量上樣，濃縮膠采用恒壓80 V(大約30 min)，分離膠采用恒壓120 V，待溴酚藍(lán)移至分離膠底部時(shí)，終止電泳.將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，封閉1 h后，孵育一抗過(guò)夜、孵育二抗1 h，用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，用凝膠圖像分析儀分析條帶，記錄灰度值.

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Scr測(cè)定結(jié)果

術(shù)后第7天，模型組與假手術(shù)組相比，Scr水平顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明造模成功；各治療組與模型組比較，Scr水平均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.05)；芪丑湯全方組與依那普利組比較，能降低Scr水平(P<0.05).術(shù)后第14天，與假手術(shù)組相比，模型組Scr水平差異顯著(P<0.01)；與模型組比較各治療組的Scr水平有不同程度的降低(P<0.01，P<0.05)，說(shuō)明各治療組具有一定的治療作用；芪丑湯全方組與依那普利組比較，能降低Scr水平(P<0.05).見(jiàn)表1.

組別n7d/(μmol·L-1)14d/(μmol·L-1)假手術(shù)組953．46±2．6754．27±2．09模型組10113．84±4．59a131．56±5．83a依那普利組994．08±3．32c99．06±457b芪丑湯全方組1063．46±5．59bd66．46±4．79bd泄?jié)峄鼋M1071．60±5．62b78．53±5．56b溫補(bǔ)脾腎組1082．74±6．44c87．87±8．84c

注：a與假手術(shù)組比較P<0.01；b與模型組比較P<0.01；c與模型組比較P<0.05；d與依那普利組比較P<0.05；e與依那普利組比較P<0.01.以下標(biāo)注同.

3.2 BUN測(cè)定結(jié)果

術(shù)后第7天，模型組與假手術(shù)組相比，BUN水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較芪丑湯全方組、溫補(bǔ)脾腎組及泄?jié)峄鼋M的BUN水平不同程度的降低(P<0.01，P<0.05).術(shù)后第14天，模型組與假手術(shù)組相比，BUN水平差異顯著(P<0.01)，說(shuō)明造模成功；各治療組與模型組比較，BUN水平均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.05)；芪丑湯全方組與依那普利組比較，能降低BUN水平(P<0.05)；結(jié)合BUN水平的下降推斷各治療組能夠改善腎功能，且14天比7天療效好.見(jiàn)表2.

組別n7d/(mmol·L-1)14d/(mmol·L-1)假手術(shù)組92．79±0．383．12±0．55模型組108．72±0．91a9．91±0．64a依那普利組95．72±0．48c6．73±0．37b芪丑湯全方組103．59±0．31b3．70±0．45bd泄?jié)峄鼋M103．77±0．62b5．54±0．29b溫補(bǔ)脾腎組103．97±0．76b6．08±0．32b

注：同上.

3.3 對(duì)UUO大鼠腎臟重量的影響

2) 浙北湖州地區(qū)是浙江內(nèi)河集裝箱運(yùn)輸?shù)闹匾⒌?，若以杭州城區(qū)五級(jí)航道航寬限制全線通航船舶，將不利于地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和浙北高等級(jí)航道水運(yùn)優(yōu)勢(shì)發(fā)揮。

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟的重量有非常顯著的差異(P<0.01).各治療組與模型組相比，腎臟濕重減輕(P<0.05；P<0.01)，說(shuō)明各治療組可以減輕腎臟積水的程度；芪丑湯全方組與依那普利組比較，梗阻腎臟濕重減輕(P<0.05)，芪

丑湯全方組抑制腎臟積水的作用要優(yōu)于依那普利，且中藥復(fù)方作用持久.見(jiàn)表3.

組別n7d腎重/g14d腎重/g假手術(shù)組90．69±0．020．88±0．03模型組101．74±0．05a2．15±0．16a依那普利組91．27±0．56b1．71±0．11c芪丑湯全方組100．92±0．58bd1．27±0．09bd泄?jié)峄鼋M101．13±0．10b1．40±0．14b溫補(bǔ)脾腎組101．26±0．07b1．64±0．10

注：同上.

3.4 對(duì)UUO大鼠腎小管損傷指數(shù)的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎小管與腎小管之間呈現(xiàn)“背靠背”的特征，未見(jiàn)明顯的病理改變.第14天模型組腎小管皮質(zhì)部分可以觀察不同程度的腎小管擴(kuò)張及萎縮，腎小管上皮細(xì)胞失去原有的緊密規(guī)則的排列，取而代之的是腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，第14天模型組尤其顯著，并有壞死和脫落，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織使得間質(zhì)間隙增加.與假手術(shù)組比較，第7天、14天模型組的腎小管損傷指數(shù)顯著增加(P<0.01).各治療組與模型組比較，腎小管擴(kuò)張及腎小管變性脫落的情況有不同程度的減輕，7天UUO中藥復(fù)方給藥組中僅芪丑湯全方組與模型組相比有差異(P<0.05)，14天UUO中芪丑湯全方組、溫補(bǔ)脾腎組及泄?jié)峄鼋M與模型組比均有顯著性差異(P<0.01).顯示中藥復(fù)方各治療組藥效發(fā)揮具有時(shí)間依賴(lài)性.各治療組能夠減輕腎小管損傷情況.第14天UUO芪丑湯全方組與依那普利組相比，對(duì)腎小管損傷指數(shù)的影響有差異(P<0.05).見(jiàn)表4、圖1、2.

組別n7d腎小管損傷指數(shù)14d腎小管損傷指數(shù)假手術(shù)組92．43±0．182．28±0．68模型組109．20±0．44a14．48±2．26a依那普利組96．30±0．36c10．02±1．19b芪丑湯全方組104．27±0．64b6．2±1．05bd泄?jié)峄鼋M106．53±0．749．4±2．65b溫補(bǔ)脾腎組106．40±0．758．96±2．15b

注：同上.

A—假手術(shù)組(HE×400) B—模型組(HE×400) C—依那普利組(HE×400) D—芪丑湯全方組(HE×400) E—泄?jié)峄鼋M(HE×400) F—溫補(bǔ)脾腎組(HE×400)圖1 各組大鼠腎組織第7天HE染色

注：A—假手術(shù)組(HE×400) B—模型組(HE×400) C—依那普利組(HE×400) D—芪丑湯全方組(HE×400) E—泄?jié)峄鼋M(HE×400) F—溫補(bǔ)脾腎組(HE×400)圖2 各組大鼠腎組織第14天HE染色

3.5 對(duì)UUO大鼠腎組織GRP78表達(dá)的影響

假手術(shù)組可見(jiàn)少量GRP78蛋白表達(dá).模型組與假手術(shù)組比較，GRP78蛋白表達(dá)增多，有顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明造模成功并引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生；各治療組與模型組比較，GRP78的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，顯示各治療組均能夠抑制GRP78蛋白的表達(dá)；芪丑湯全方組與依那普利組比較，能顯著抑制GRP78的表達(dá)(P<0.01).見(jiàn)表5、圖3.

注：同上.

圖3 各組大鼠腎組織GRP78蛋白表達(dá)的影響

3.6 對(duì)UUO大鼠腎臟GRP94表達(dá)的影響

假手術(shù)組GRP94蛋白表達(dá)較少.模型組與假手術(shù)組比較，GRP94蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，依那普利組、全方組、泄?jié)峄鼋M、溫補(bǔ)脾腎組的GRP94蛋白表達(dá)均有顯著性差異(P<0.01)；全方組與依那普利比較，GRP94蛋白表達(dá)降低，有顯著性差異(P<0.01).見(jiàn)表6、圖4.

組別n灰度值假手術(shù)組90．46±0．08模型組101．37±0．08a依那普利組91．06±0．07b芪丑湯全方組100．84±0．09be泄?jié)峄鼋M100．98±0．07be溫補(bǔ)脾腎組101．22±0．05b

注：同上.

圖4 各組大鼠腎組織GRP94蛋白表達(dá)的影響

4 討 論

慢性腎病被公認(rèn)為21世紀(jì)全球公共健康問(wèn)題，危害僅次于腫瘤及心臟病，成為第三大“殺手”[8].對(duì)慢性腎病的預(yù)防和治療至關(guān)重要.腎間質(zhì)纖維化是慢性腎病的前期，也是慢性腎病發(fā)展至終末期的共同途徑.本研究通過(guò)建立UUO模型，探討芪丑湯拆方影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腎間質(zhì)纖維化起到治療的作用.

GRP78、GRP94均存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是熱休克蛋白家族的成員，也是分子伴侶[9].正常的生理情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)(URE)調(diào)節(jié)作用，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定.三種跨膜蛋白N末端與糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78結(jié)合，并處于未激活的狀態(tài).轉(zhuǎn)錄活化GRP78的啟動(dòng)子是啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的顯著特征之一，使GRP78高表達(dá)[10].但在腎受到損傷的情況下，未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白的堆積會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與GRP78結(jié)合，使得蛋白處于易被折疊的狀態(tài)，三種跨膜蛋白便與GRP78解離開(kāi)來(lái)[11].和GRP78作為分子伴侶發(fā)揮功能的還有GRP94，它們可以結(jié)合于錯(cuò)誤折疊蛋白和未組裝的復(fù)合物.在葡萄糖缺乏、酸中毒、嚴(yán)重缺氧等不利環(huán)境中，蛋白出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊或未折疊，這些錯(cuò)誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大量蓄積導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)一步啟動(dòng)UPR.作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白之一，GRP94在等電點(diǎn)的改變、亞細(xì)胞定位的改變及蛋白表達(dá)水平的改變都可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12].當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GRP94通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件(endoplasmic reticulum stress element，ERSE)的相互作用，誘導(dǎo)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達(dá)，下調(diào)Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13-17].GRP94與GRP78(免疫球蛋白結(jié)合蛋白，Bip)，在功能方面有很多相似的地方并協(xié)同發(fā)揮作用[18].且在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示，假手術(shù)組GRP78、GRP94表達(dá)較少.模型組與假手術(shù)組比較，GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明造模成功并引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生.各治療組與模型組比較，GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，提示各治療組均能夠抑制GRP78、GRP94蛋白的表達(dá)；芪丑湯全方組與依那普利組比較，能顯著抑制GRP78、GRP94的表達(dá)(P<0.01).[19]

有研究表明腎小管上皮細(xì)胞對(duì)ERS的誘導(dǎo)物極為敏感，誘導(dǎo)物可以擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的糖基化修飾，肽鏈不能正常進(jìn)行折疊和組裝，導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的積累，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)的蛋白質(zhì)降解作用不足以降解蛋白質(zhì)，過(guò)度的積累則使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生ERS并且誘導(dǎo)UPR.本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果可知，與假手術(shù)組比較，7天、14天模型組的腎小管損傷指數(shù)顯著增加(P<0.01).各治療組與模型組比較，腎小管擴(kuò)張及腎小管變性脫落的情況有不同程度的減輕，7天芪丑湯全方組與模型組相比有差異(P<0.05)，14天芪丑湯全方組、溫補(bǔ)脾腎組及泄?jié)峄鼋M與模型組比均有顯著性差異(P<0.01).提示各治療組能夠減輕腎小管損傷情況.14天UUO溫補(bǔ)脾腎泄?jié)峄龇ㄅc依那普利相比，對(duì)腎小管損傷指數(shù)的影響顯著(P<0.05).

以上研究表明，芪丑湯可通過(guò)提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)，對(duì)腎間質(zhì)纖維化起到治療的作用.腎病以正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)，其病位在脾腎，但往往波及肝、心、肺、胃等諸臟腑.以脾腎陽(yáng)虛，濕濁瘀毒為病機(jī)關(guān)鍵，故治當(dāng)溫補(bǔ)脾腎、泄?jié)峄?

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Study on effects of Qichou Tang and its broken prescriptions for ERS chaperones on RIF in kidney tissue of rats

ZHANG Cui1, ZHOU Yan-yan1, ZHOU Ya-jie1, LU Ying2, WANG Dan-feng1

(1. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. Heilongjiang Songhuajiang Pharmaceutical Limited, Harbin 150056, China)

To investigate its mechanism of Qichou Tang decomposed group on renal tissue endoplasmic reticulum stress chaperone of rats with renal interstitial fibrosis. Unilateral ligation of ureter was carried out to establish the rat model of renal interstitial fibrosis. The rats were randomly divided into sham operation group, model group, enalapril group, Qichou Tang group, warming spleen group, Xiezhuo Huayu group. On the 7th and 14th day after modeling, the rats were killed, respectively. The serum was collected for measuring of creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN); the left kidneys which were taken out were weighed for analysis and comparison, renal edema was observed; the assessment of tubular damage index and the degree of renal interstitial fibrosis were measured by HE staining; protein expression levels of endoplasmic reticulum chaperones GRP78, GRP94 in each experimental group were measured by Western blotting. Results indicated that Scr, BUN levels were significantly lower in treatment group and model group on the 7th and 14th day (P<0.01,P<0.05); Scr level was a significant difference in Qichou Tang group and enalapril group on 7th day (P<0.05); it is significant that Scr, BUN levels were obvious reduced in Qichou Tang group and enalapril group on 14th day (P<0.05); in addition to Warming spleen group on the 14th day, kidney weight was reduced in all treatment group after 7th and 14th day (P<0.01,P<0.05) ; kidney weight was significantly reduced in Qichou Tang group and enalapril group (P<0.05); Qichou Tang group could more significantly alleviate renal tubular injury than the model group on 7th day(P<0.05); the difference in renal tubular injury was observed in Qichou Tang group and enalapril group on 14th day (P<0.05); there was significant difference in protein expressions of GRP78, GRP94 in Qichou Tang group and Xiezhuo Huayu group compared with model group on 14th day(P<0.01), Qichou Tang group could more significantly inhibit protein expression of GRP78, GRP94 than the enalapril group (P<0.01). Qichou Tang group can protect kidney function of rats with unilateral ureteral obstruction; alleviate kidney hydronephrosis; reduce renal tubular damage index; reduce the protein expressions of GRP78, GRP94, thus interference apoptotic pathway of ER stress-mediated process; impede renal interstitial fibrosis induced by apoptosis deposition. The role of each treatment group on 14th day was better than that on 7th day, Xiezhuo Huayu group was better than warming spleen group.

Qichou Tang; RIF; ERS; GRP78; GRP94

2015-01-28.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373547)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(D201147)；黑龍江省教育廳基金項(xiàng)目(11531451)

張 翠(1958-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥治療腎病.

R285

A

1672-0946(2015)05-0520-07