RP-HPLC 純化堿性疏水肽的條件優(yōu)化

陸 旋

（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學院應用工程系，浙江 杭州 310018）

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種多肽類藥物，多肽在臨床醫(yī)學中有巨大的應用價值。自從發(fā)明固相法化學合成多肽以來，有關(guān)各種活性多肽的化學合成有了很大發(fā)展[1]。多肽是由蛋白質(zhì)中20 種氨基酸以不同組成和排列方式通過肽鍵（也稱酰胺鍵）相互連接形成的化合物的總稱[2]。本實驗所用為較為復雜的12 肽。從現(xiàn)代分離科學理論得出，色譜和電泳是目前所知的分離效果最佳的兩種方法。電泳僅能用于分離而不能用于多肽的制備[3]。本實驗所用為反相高效液相色譜法。反相高效液相色譜（RP-HPLC）是利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑或其水溶液作為流動相，根據(jù)溶質(zhì)疏水性的差別進行分離純化的洗脫色譜法[4]。RP-HPLC 主要用于分子量低于5000 的多肽的分離純化，因其具有分離效果好、分辨率高、重復性好、分析速度快等優(yōu)點。因此，RP-HPLC 是目前分離純化和制備多肽的主要手段[5]。本文擬用RP-HPLC 對化學合成的堿性疏水12 肽進行分離、純化和制備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 多肽

合成的堿性疏水12 肽粗品由杭州中肽生化有限公司提供。其氨基酸序列如下所示：堿性疏水12 肽：Ala-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Pro-Ala-Thr-Gly-Gly-Lys（Biotion）。

1.1.2 試劑

制備級色譜乙腈；分析級色譜乙腈；三氟乙酸（TFA）（美國Sigma 公司）；純化水（哇哈哈有限公司桶裝20 L）；流動相A 液[水+0.1% TFA（V/V/%）]；流動相B 液[乙腈+0.1%TFA（V/V/%）]。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器：三角瓶、離心管、液氮瓶、攪拌棒、廢液瓶、藥匙。

設(shè)備：瓦里安HPLC 高效液相色譜儀（長春博盛量子科技有限公司）、GLP-ID 25.4×450 mm C18100A 10um 制備色譜柱（成都格萊精密儀器有限公司）、Luna 5u C18（2）150×4.60 mm 5 micron 分析色譜柱（成都格萊精密儀器有限公司）、KH-300型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）、SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）、FA20043 萬分之一電子天平（上海越平科學儀器有限公司）、TWT2003H 千分之一天平（杭州萬泰天華儀器有限公司）、冷凍干燥機FD-1A-50（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）、GPDG-25 進口凍干機、HEWLETT SERIES// PACKARD 1090 Liquid Chromatograph。

1.3 實驗方法

1.3.1 多肽溶解

將裝在離心管里的堿性疏水12 肽固體用藥匙取適量放于燒杯中，碾成粉末，加入乙腈和水（7:3），將燒杯放于超聲波儀器中進行攪拌溶解，直至溶液變得澄清透明。將溶解完的液體用循環(huán)水式真空泵過濾，收集并備用。

1.3.2 儀器處理準備

以100%流動相A 液沖洗RPLC 色譜柱8 min，然后進行線性梯度洗脫直至達到要求的B 液濃度[乙腈+0.1% TFA（V/V/%）]。

1.3.3 上樣

將B 泵放入溶解完的多肽中，設(shè)置A、B 泵流速為各50%進行上樣，上樣中要多次少量的加溶劑使多肽完全進入儀器中，上完樣停泵，設(shè)置合適的梯度進行走樣。本實驗分別對梯度方式，進樣量進行條件優(yōu)化，比較分析所得結(jié)果。

1.3.3.1 梯度方式的優(yōu)化實驗

以堿性疏水12 肽作為粗品，在其他實驗條件不變的情況下，選擇不同的梯度方式，進行單因素試驗，以尋找出在純化過程中最合適的線性梯度。線性梯度模式見表1。

1.3.3.2 進樣量

以堿性疏水12 肽作為粗品，在其他實驗條件不變的情況下，選擇不同的進樣量，進行單因素試驗，以尋找出在純化過程中最合適的進樣量，使最后的收集量最大化。進樣量改變見表2。

表2 不同進樣量

1.3.4 樣品的收集

根據(jù)峰型收集各色譜餾分，保留并進行檢測。

1.3.5 儀器處理

收集完樣品后，用100 % B 液洗脫10 min，使殘余在柱上的物質(zhì)完全沖洗下來,然后再用相應濃度的A 液平衡色譜柱，以構(gòu)成一個完整的色譜過程。流速1.0 mL/min，堿性疏水12 肽的檢測波長為220 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 RP-HPLC 對堿性疏水肽粗制品分析結(jié)果

以乙腈作為流動相，用RP-HPLC 對堿性疏水12 肽的粗品進行分析。圖1 為堿性疏水12 肽粗品的分析圖。

由圖1 可見，圖中出現(xiàn)了明顯的5 個峰，目標峰為11.004 時出現(xiàn)的峰，峰的吸收不高，有很多雜峰，證明粗品的純度低，由圖可知，純度只有57.4%。粗品主峰附近有小峰，較難分離。

圖1 堿性疏水12 肽粗品的分析檢測圖

2.2 改變梯度方式對堿性疏水肽分離純化結(jié)果

圖2 30%→60%B 梯度RP-HPLC 色譜分離圖

圖2 為30%→60%B 梯度下的色譜分離圖，由圖可知目標峰為色譜峰8，即含有所要收集的樣品，各小峰為分離出來的雜質(zhì)，色譜峰9、10、11為洗脫出來的無效峰，保留色譜峰8，用于檢測。

圖3 色譜峰8 的分析檢測圖

圖4 20%→40%B 梯度的RP-HPLC 色譜分離圖

圖3 為色譜峰8 的分析檢測圖，由圖中可見在30%→60%B 梯度下收集的目標峰檢測結(jié)果為79.77%，純度與粗品相比有所提高，但效果不明顯。

由圖4 可見，在20%→40%B 梯度下的色譜分離圖，由圖可知目標峰為色譜峰3，即含有所要收集的樣品，各小峰為分離出來的雜質(zhì)，保留色譜峰3，用于檢測。

圖5 色譜峰3 的分析檢測圖

圖5 為色譜峰3 的分析檢測圖，由圖中可見在20%→40%B 梯度下收集的目標峰檢測結(jié)果為82.09%，純度與粗品相比大有提高，與30%→60%B 梯度下收集的目標峰檢測相比也有所提高，但未達到目標要求95%的純度。

圖6 25%→35%B 梯度的RP-HPLC 色譜分離圖

圖6 為25%→35%B 梯度下的色譜分離圖，由圖可知目標峰為色譜峰3，即含有所要收集的樣品，各小峰為分離出來的雜質(zhì)，保留色譜峰3，用于檢測。

圖7 色譜峰3 的分析檢測圖

圖7 為色譜峰3 的分析檢測圖，由圖中可見在25%→35%B 梯度下收集的目標峰檢測結(jié)果為96.62%，純度與粗品相比大有提高，與30%→60%B 和20%→40%B 梯度下收集的目標峰檢測相比也大有提高，且純度超過所要求純度95%。

2.3 改變進樣量對堿性疏水肽分離純化后成品效率的結(jié)果

由表3 可見進樣量80 mg 到150 mg 逐漸增加的過程中，其純化后成品的效率也不斷提升，當進樣量超過150 mg 達到160 mg 時，其純化后成品的效率反而降低，在進樣的過程中，應選用150 mg。

表3 不同進樣量的效率

3 結(jié)論

本文主要從純化過程中的進樣量以及梯度方式兩個方面對堿性疏水12 肽的反相高效液相色譜進行條件優(yōu)化，最后選擇線性梯度為25%→35%B，以150 mg 為進樣量，作為最佳純化條件。在該優(yōu)化條件下，可收集目標峰檢測純度為96.62%的堿性疏水12 肽，此結(jié)果不僅達到目標要求，而且成品收集效率可高達80%。

[1]袁慶龍，候文義.Ni-P 合金鍍層組織形貌及顯微硬度研究[J].太原理工大學學報，2001，32（1）：51-53.

[2]李醫(yī)明.多肽類PPLC 純化法[J].生物化學與生物物理學報，2000，3（4）：351-355.

[3]張艷華，李影，巨芳，等.高效液相色譜分離純化多肽的研究進展[J].中國食物與營養(yǎng)，2009，9：34-36.

[4]Smith D D，Saha S，F(xiàn)ang G，et al.Modifications to the N—terminus but not the C-terminus of calcitonin generelated peptide（8-37）produce antagonists with increased affinity[J].Med Chem，2003，46（12）：2427-2435.

[5]郝志芳.利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析和制備多肽[D].常州工程職業(yè)技術(shù)學院，2009:1-19.