基于雙柱固相萃取-色質聯用技術同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留

張鑫，吳劍平，嚴鳳，陸淳，顧欣

(上海市動物疫病預防控制中心，上海201103)

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基于雙柱固相萃取-色質聯用技術同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留

張鑫，吳劍平，嚴鳳，陸淳，顧欣*

(上海市動物疫病預防控制中心，上海201103)

建立了雙柱固相萃取-液相色譜-串聯質譜法，可實現對雞肉中金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛胺、嗎啉胍、利巴韋林、阿昔洛韋、更昔洛韋、奧司他韋等8種抗病毒藥物的同時分析。采用三氯乙酸水溶液-乙腈對雞肉中8種抗病毒藥物殘留同時提取，依次通過石墨化碳柱和強陽離子交換柱以實現對目標藥物的富集、凈化，選用石墨化碳色譜柱進行分離，超高效液相色譜-串聯質譜檢測。本文通過研究不同提取溶液、固相萃取柱及色譜柱對檢測結果的影響，最終建立優(yōu)化的檢測方法,采用外標法計算，檢測限1 μg/kg，定量限2 μg/kg，添加濃度在2～200 μg/kg范圍內的回收率大于80%，適用于雞肉中8種抗病毒藥物的同時分析。

石墨化碳；抗病毒藥物；殘留檢測

在我國金剛烷類、核苷類、雜環(huán)雙胍類以及神經氨酸酶抑制劑的抗病毒藥物都曾被報道用于獸醫(yī)臨床治療病毒感染[1]，近年來，為預防禽流感，抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)有濫用現象，2012年的“速成雞”事件中檢出雞肉中殘留有金剛烷胺和利巴韋林，給我國家禽業(yè)帶來了嚴重的負面影響?？共《舅幬镌谛笄蒺B(yǎng)殖業(yè)的非法使用屢禁不止，同時國內外對動物組織中的抗病毒藥物多殘留的檢測方法研究較少，給此類藥物的監(jiān)管帶來了不便?？共《舅幬锏淖饔脵C理和理化性質各異，傳統前處理方法具有一定選擇性，且動物組織中藥物殘留量低，經過復雜的提取凈化去脂步驟后，回收率不高，目前的文獻報道[2-4]檢測雞肉中的抗病毒藥物殘留的方法多局限與某一類抗病毒藥物，或采用通用的QuEChERS法進行前處理，雜質去除不夠充分，本文建立的雙柱固相萃取法是利用固相萃取柱對藥物的不同選擇性，將藥物分別保留在石墨化碳柱和強陽離子交換柱上，并通過洗脫液置換，將8種藥物濃縮在同一溶劑中，進而實現了在液質聯用儀上的同時分析，與目前有文獻[4-6]報道的方法相比，可同時檢測的藥物種類更多，操作簡便，檢測限更低，實用性和創(chuàng)新性較強。本研究建立的同時檢測雞肉中8種抗病毒藥物殘留量的檢測方法，對于有效監(jiān)控該類藥物的使用、保障我國動物性食品安全具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 Waters TQ Xevo串聯四極桿質譜(ESI+)、強陽離子交換固相萃取柱(Waters MCX 3mL/60mg)、石墨化碳固相萃取柱(Thermo Hyper Carb 3mL/200 mg)、石墨化碳色譜柱(Thermo Hyper Carb 100 mm×2.1 mm，5 μm)；高速冷凍離心機(Allegra X-22R，美國Beckman Coulter)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。金剛烷胺(Amantadine，ATD)，金剛乙胺(Rimantadine，RTD)，美金剛胺(Memantine，MMT)，嗎啉胍(Moroxydine，MXD)，利巴韋林(Ribavirin，RBV)，阿昔洛韋(Acyclovir，ACLV)，更昔洛韋(Ganciclovir，GCLV)，奧司他韋(Oseltamivir，OSTV)(純度均≥99.0 %，德國Dr.Ehrenstofer GmbH)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國Merk)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜方法 色譜柱：ThermoHyperCarb(100 mm×2.1 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流速0.2 mL/min,進樣量10 μL，流動相：A為乙腈，B為0.005 mol/L乙酸銨，采用梯度洗脫程序: 10%A起始保持1 min，2 min時變化至40%A，保持2 min，6 min時變化至10%A，保持2 min。

1.2.2 質譜方法 質譜條件為：選擇正離子模式，電離模式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度500 ℃；，碰撞氣壓力0.24 Pa，定性與定量離子對以及對應的撞擊能量見表1。

1.2.3 前處理方法 取5 g雞肌肉置于離心管中，加2%三氯乙酸水溶液/乙腈(80:20)10 mL提取，Ika勻漿機勻漿1 min，震蕩提取15 min，10000 r/min離心5 min，取上清液依次通過HyperCarb柱(乙腈、甲醇各3 mL活化)和MCX柱(甲醇、水各3 mL活化)，0.2%甲酸水溶液/乙腈(60:40)1 mL洗脫HyperCarb柱,用試管收集洗脫液,備用，MCX柱依次用水、甲醇各3 mL洗滌，氨水甲醇3 mL洗脫，用試管收集洗脫液，N2吹干，殘渣用備用液溶解，上機。

2 結果與分析

2.1 檢測限、定量限和回收率 在空白雞肉中添加標準工作溶液，使其含量分別為2.0、10.0、50.0、200.0 μg/kg，每個濃度平行添加3份，重復3批次，按1.2.3項方法處理后測定，結果表明在2.0～200.0 ng/g內回收率良好。以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限( LOD) 為1.0 μg/kg，以S/N≥10 確定方法的定量限( LOQ) 為2.0 μg/kg(表2、圖1)。

表1 抗病毒類藥物標準品及其內標質譜參數

* 定量離子對

表2 空白雞肉中添加8種藥物的添加回收率及批內批間差異

續(xù)表

圖1 空白雞肉中8種抗病毒藥物MRM譜圖的信噪比(2 μg/kg)

2.2 前處理方法的選擇 為了研究不同前處理方法對藥物的選擇性，比較了直接提取法、分散固相萃取法以及固相萃取柱法。結果顯示，使用酸性水溶液或酸性乙腈直接提取可以提取出所有藥物，但稀釋倍數較大，酸性乙腈提取后可氮吹濃縮，濃縮倍數增加的同時，基質干擾也較大；分散固相萃取法在酸性乙腈直接提取的基礎上加入C18粉和PSA會導致藥物回收率有一定降低；固相萃取柱法在提純和濃縮方面均有較好效果，但8種藥物的性質差異較大，因此選用單一固相萃取柱無法將全部藥物都保留，需考慮串接固相萃取柱來實現對雞肉中所有抗病毒藥物的富集和凈化，嘗試采用混合陽離子交換柱(MCX)和石墨化碳固相萃取柱(Hypercarb)進行串接，取得了較好的效果。

為保證藥物可同時被提取出來，又能夠在兩種小柱上實現分離和保留，還需要探討藥物的性質、提取液的選擇、固相萃取小柱的選擇性以及色譜柱的匹配度等問題。

2.3 藥物性質及提取液的選擇 表3給出了8種藥物理化特性的理論值，包括水溶解系數(LogS)、水油分配系數(LogP)、解離系數(pKa)等。8種藥物屬于不同類別的抗病毒藥物，溶解性質和酸堿性質差異較大，單用水相或有機相都不能實現完全提取，因此嘗試了甲酸水-乙腈、水-乙腈、乙酸銨-乙腈和三氯乙酸水溶液-乙腈4種提取液，結果顯示，2%三氯乙酸水溶液-乙腈(80/20)效果最好，一方面，可以提取全部藥物并起到沉淀蛋白的作用，另一方面，石墨化碳固相萃取柱能夠對對水相較多的體系進行保留和凈化，而混合陽離子交換柱要求較低pH值，2%三氯乙酸水溶液-乙腈(80/20)同時滿足了上述全部條件。

表3 8種抗病毒藥物的溶解度參數及解離系數

2.4 固相萃取柱選擇性考察 研究了反相固相萃取柱(HLB)、混合陽離子交換柱(MCX)、石墨化碳固相萃取柱(Hypercarb)等對陽性添加樣品(2 μg/kg)的檢測結果。HLB回收率很低，不適合抗病毒藥物的分析，MCX和Hypercarb分別可實現對部分藥物的富集凈化，分析可能存在無保留或難以用同一種溶劑洗脫下來的情況，有文獻曾報道類似情況[8]，將兩者串聯使用，可最大程度的發(fā)揮兩者的作用，獲得所有藥物的較高回收率。試驗中發(fā)現，Hypercarb能夠保留的藥物更多且作用力較弱，易于被洗脫，因此，先通過Hypercarb，使藥物優(yōu)先保留在Hypercarb上，可防止藥物在MCX柱上產生較強的鍵合作用而影響回收率(表4)。

表4 雞肉中8種抗病毒藥物采用不同固相萃取柱凈化后的檢測結果

ND未出峰，○回收率<60%，√回收率≥60%，△回收率≥80%

2.5 色譜柱適用性考察 采用不同的色譜柱和流動相體系，會影響藥物的保留時間、出峰順序、響應值等，本文比較了四種色譜體系：親水色譜柱(HILIC)、反相色譜柱(HSS T3)、正相色譜柱(BEH Amide)、石墨化碳色譜柱(Hypercarb)，不同前處理方法在4種色譜體系中的分析結果見表5。

雞肉中8種藥物經QuEChERS法和Hypercarb-MCX法處理后在4種色譜體系中均有出峰，但QuEChERS法雜質干擾明顯，峰型不佳，Hypercarb-MCX法的凈化效果有明顯改善；在反相柱體系中，利巴韋林和阿昔洛韋保留不佳，在1.2 min出峰，易受雜質峰干擾；在親水色譜柱和正相色譜柱體系中金剛烷胺，金剛乙胺，美金剛胺，嗎啉胍，奧司他韋均在1.5～1.8 min出峰，易受雜質峰干擾；在石墨化碳色譜柱體系中獲得了較滿意結果(圖2)。

表5 前處理方法與4種不同色譜體系匹配度的考察

圖2 陽性添加樣品雙柱法-石墨化碳柱色譜體系下的TIC圖(2 μg/kg)

3 小結

本文建立的雙柱固相萃取-串聯質譜法將雞肉中8種藥物通過串接的固相萃取柱進行充分的富集凈化，最終濃縮在1mL溶劑中，凈化效果更好，進而采用對抗病毒藥物保留極佳的石墨化碳色譜柱進行分離，減少了藥物在串聯質譜上的基質效應和雜質干擾，可使最低檢測濃度降低至1 μg/kg，較文獻方法更靈敏，準確度更高，適合雞肉中多種抗病毒藥物殘留的定性定量檢測。

[1] 孫雷,李丹,畢言鋒,等.抗病毒藥物的毒性及殘留檢測方法研究進展[J]. 中國獸藥雜志,2013,10:57-61.

[2] 尹暉,孫雷,畢言鋒,等. 雞肉和雞蛋中金剛烷胺與金剛乙胺殘留檢測UPLC-MS/MS法研究[J]. 中國獸藥雜志,2014,48(6):32-35.

[3] 魏秀麗,高迎春,陳玲,等. 超高效液相-串聯質譜法測定雞肉組織中金剛烷胺殘留[J]. 中國獸藥雜志,2013,47(6):53-55.

[4] 曲斌,朱志謙,陸桂萍,等. UPLC-MS/MS快速測定雞肉中金剛烷胺和氟喹諾酮類藥物殘留[J]. 中國獸藥雜志,2013,47(7):50-54.

[5] 艾連峰,馬育松,陳瑞春,等.在線凈化液相色譜串聯質譜法測定動物源食品中金剛烷胺的殘留[J]. 分析化學,2013,8:1194-1198.

[6] 云環(huán),崔鳳云,嚴華,等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺[J]. 色譜,2013,8:724-728.

[7] 祝偉霞,楊冀州,袁萍,等.超高效親水色譜-串聯質譜法快速檢測雞肉及其制品中的利巴韋林及其代謝物的總殘留量[J]. 色譜,2013,10:934-938.

[8] 劉正才,楊方,余孔捷,等.液相色譜-電噴霧串聯質譜法同時檢測雞組織中5種抗病毒類藥物的殘留量[J]. 色譜,2012,12:1253-1259.

[9] Bjorn J. A. Berendsen,Robin S. Wegh,Martien L. Essers,etal. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2012,402(4):1611-1623.

(編輯：侯向輝)

Simultaneous Analysis of Eight Antiviral Drug Residues in Chicken Based on a Double-column Designed Solid Phase Extraction Combined with LC-MS/MS Method

ZHANG Xin, WU Jian-ping, YAN Feng, LU Chun, GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A novel detection method based on a double-column designed solid phase extraction(SPE)combined with LC-MS/MS was developed for the simultaneous analysis of eight antiviral drugs residues in chicken, including amantadine, rimantadine, memantine, moroxydine, ribavirin, acyclovir, ganciclovir and oseltamivir. A graphitic carbon column and a strong cation exchange column were connected and used in series to enrich and purify the analytes from the trichloroacetic acid-acetonitrile aqueous solution.The eight drugs were separated by Hypercarb column and detected by LC-MS/MS method.The influences of the used dilutionsolvent, solid phase extractioncolumns andchromatographic columns on the test results were investigated to optimize the detection method. The results showed a low limit of detection down to 1 μg/kg. And the limit of quantization of 2 μg/kg was achieved. Moreover, the fortified concentrations could range from 2 to 200 μg/kg, and the recovery was higher than 80%. Hence, the detection method presented would be a promising candidate if the quick analysis for multicomponent and complicated samples was needed.

graphitic carbon; antiviral drug; residue detection

上海市市級農口系統青年人才成長計劃：滬農青字(2014)第2-5號；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203023)

張鑫，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析研究。

顧欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-08-03

A

1002-1280 (2015) 09-0045-06

S859.84