HPLC法測定二仙湯提取物中抗骨質(zhì)疏松有效成分的含量Δ

許紅濤，李 媛，何勇靜，袁婷婷，張乃丹，張巧艷#（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350108；.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 00433）

二仙湯收載于《中醫(yī)方劑臨床手冊》中，由淫羊藿、仙茅、知母、關(guān)黃柏、當(dāng)歸和巴戟天6味中藥組成，具有溫腎益精、滋陰降火的雙重調(diào)節(jié)功能，臨床上用于治療婦女更年期綜合征和骨質(zhì)疏松癥[1-2]。為了明確二仙湯的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者以成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞為模型，對二仙湯水提物進(jìn)行了抗骨質(zhì)疏松活性成分的導(dǎo)向分離，以去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠為模型，對所獲得的有效成分進(jìn)行了抗骨質(zhì)疏松的作用驗(yàn)證，明確二仙湯中的淫羊藿黃酮、知母皂苷和黃柏小檗堿為其抗骨質(zhì)疏松的有效成分[3]。隨后，又進(jìn)一步以黃酮、知母皂苷和小檗堿為指標(biāo)，優(yōu)化了二仙湯的提取方法和抗骨質(zhì)疏松部位的制備方法。為此，筆者建立了采用高效液相色譜（HPLC）法測定二仙湯提取物中抗骨質(zhì)疏松主要有效成分淫羊藿苷、小檗堿和知母皂苷含量的方法，為質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Cary 50紫外可見分光光度計(jì)（美國瓦里安公司），LC-10AD HPLC儀，包括SCL-10A自動進(jìn)樣器、SPD-10A檢測器、LC-10AD泵、Chrom Spirit Perfect工作站（日本島津公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

淫羊藿苷（批號：110737-201311，純度≥98%）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201212，純度≥98%）、菝葜皂苷元對照品（批號：110744-201310，純度≥98%）均由中國食品藥品檢定研究院提供。

淫羊藿、仙茅、知母、黃柏、巴戟天和知母購于上海華宇藥材公司，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院張巧艷副教授鑒定，符合2010年版《中國藥典》（一部）的要求。經(jīng)測定，淫羊藿中淫羊藿苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.1%，黃柏中小檗堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.683%，知母中皂苷類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.07%。

2 方法與結(jié)果

2.1 二仙湯提取物的制備

按照處方稱取藥材飲片，混合后，加50%乙醇提取3次，合并提取液。提取液減壓濃縮至密度為1.05～1.10 g/ml，即為上柱樣品液。將樣品液按1倍柱體積上樣量加入裝有ZTC-1型大孔吸附樹脂的色譜柱中，依次用12倍量水、8倍量50%乙醇和10倍量95%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮成浸膏，60 ℃干燥，得棕褐色粉末，即為二仙湯提取物。

2.2 淫羊藿苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），保護(hù)柱：Dikma Easy Guard C18（8 mm×4 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%醋酸（60∶40，V/V）；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流速：1.0 ml/min。

理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)應(yīng)不低于1 500。對照品溶液與供試品溶液在相同位置處有吸收峰出現(xiàn)，而陰性對照品溶液無此峰出現(xiàn)，表明陰性對照品溶液不干擾測定。色譜見圖1。

圖1 淫羊藿苷高效液相色譜圖A.陰性對照品；B.淫羊藿苷對照品；C.供試品；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatograms of icariinA.negative control；B.icariin reference；C.test sample；1.icariin

2.2.2 對照品溶液的制備 取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷70.0 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下二仙湯提取物約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液 以同樣的提取制備方法，制備缺淫羊藿藥材的二仙湯陰性對照提取物樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取淫羊藿苷對照品25.0 mg，置于25 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 ml含淫羊藿苷1.0 mg的貯備液。精密量取貯備液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml，置于10 ml量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得淫羊藿苷回歸方程為y＝13 123x+31.885（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，淫羊藿苷質(zhì)量濃度在40.00～90.00 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 最低定量限 以信噪比大于10計(jì)算淫羊藿苷的最低定量限約為1.00 μg/ml。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.5”項(xiàng)下淫羊藿苷對照品溶液（70.00 μg/ml），按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積的RSD為0.51%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取二仙湯提取物適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、1、2、4、6、8 h時按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積的RSD為2.02%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取二仙湯提取物適量，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，淫羊藿苷含量的RSD為0.99%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知淫羊藿苷含量的樣品，共6份，精密稱定，加入等量的淫羊藿苷對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of icariin（n＝6）

2.2.11 淫羊藿苷含量測定 取3批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中淫羊藿苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 淫羊藿苷含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of icariin（n＝3）

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），保護(hù)柱：Dikma Easy Guard C18（8 mm×4 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.3%三乙胺水溶液（20∶10∶70，V/V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0）；檢測波長：340 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；流速：1.0 ml/min。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。對照品溶液與供試品溶液在相同位置處有吸收峰出現(xiàn)，而陰性對照品溶液無此峰出現(xiàn)，表明陰性對照品溶液不干擾測定。色譜見圖2。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 ml含鹽酸小檗堿20 μg的溶液，作為對照品溶液。

圖2 鹽酸小檗堿高效液相色譜圖A.陰性對照品；B.鹽酸小檗堿對照品；C.供試品；1.鹽酸小檗堿Fig 2 HPLC chromatograms of hydrochloride berberinA.negative control；B.berberin hydrochloride reference；C.test sample；1.berberin hydrochloride

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下二仙湯提取物約10 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，混勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照品溶液 以同樣的提取制備方法，制備缺關(guān)黃柏藥材的二仙湯陰性對照提取物樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.0 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 ml含鹽酸小檗堿1.0 mg的貯備液。精密量取貯備液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 ml，置于10 ml量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，搖勻，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程為y＝24 106x－5 917.2（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在5.00～35.00 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 最低定量限 以信噪比大于10計(jì)算鹽酸小檗堿的最低定量限約為1.00 μg/ml。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.5”項(xiàng)下鹽酸小檗堿對照品溶液（20.00 μg/ml），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取二仙湯提取物適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、1、2、4、6、8 h時按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.58%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取二仙湯提取物適量，共6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿含量的RSD為1.63%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知鹽酸小檗堿含量的樣品，共6份，精密稱定，加入等量的鹽酸小檗堿對照品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test of berberin hydrochloride（n＝6）

2.3.11 鹽酸小檗堿含量測定 取3批樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見表4。

表4 鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 4 Results of content determination of berberin hydrochloride（n＝3）

2.4 知母皂苷的含量測定

2.4.1 測定方法 取“2.1”項(xiàng)下二仙湯提取物約0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入2 mol/L鹽酸20 ml，回流3 h，用60 ml氯仿分3次（10、20、30 ml）回流萃取，每次20 min；收集氯仿層，回收至干，殘?jiān)寐确氯芙獠⒍ㄈ葜?0 ml，吸取1.0 ml，用氯仿稀釋至10.0 ml，混勻，即得供試品溶液。另取菝葜皂苷元對照品，加氯仿制成每1 ml含菝葜皂苷元100 μg的溶液，作為對照品溶液。分別精密量取供試品溶液及對照品溶液各2.0 ml于具塞試管中，25 ℃水浴中吹干溶劑，分別加入5%香草醛冰醋酸0.2 ml和高氯酸0.8 ml，渦旋10 s混勻，于70 ℃水浴中放置20 min；取出后立即置冰水浴中冷卻2 min，分別加入9.0 ml冰醋酸，混勻；以試劑為空白，按紫外-可見分光光度法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅤA]規(guī)定，在（590±2）nm波長處測定吸收度，計(jì)算所得值乘以2.16，即得。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密稱取菝葜皂苷元對照品，用氯仿配制成1 ml含菝葜皂苷元0.20 mg的溶液，分別精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml于10.0 ml具塞試管中，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理和測定。以菝葜皂苷元質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得菝葜皂苷元的回歸方程為y＝77x－1.625 4（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，菝葜皂苷元質(zhì)量濃度在8.00～40.00 μg/ml范圍內(nèi)與吸收度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一對照品溶液（24.00 μg/ml），按“2.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測定6次。結(jié)果，菝葜皂苷元吸光度的RSD為1.06%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0、20、40、60、90 min時進(jìn)行測定。結(jié)果，菝葜皂苷元吸光度的RSD為1.52%，表明供試品溶液經(jīng)顯色反應(yīng)后在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取二仙湯提取物共6份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測定。結(jié)果，菝葜皂苷元含量的RSD為1.69%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 在已知知母皂苷含量的樣品中加入定量菝葜皂苷元對照品，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 知母皂苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 5 Results of recovery test of timosaponin（n＝6）

2.4.7 知母皂苷含量測定 取3批樣品，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測定樣品中知母皂苷的含量，結(jié)果見表6。

表6 知母皂苷含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 6 Results of content determination of timosaponin（n＝3）

3 討論

淫羊藿是二仙湯處方中的君藥，淫羊藿苷為其主要的化學(xué)成分。研究表明，淫羊藿苷能夠減緩去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性的提高和骨礦化結(jié)節(jié)的形成[3-5]，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收[6]。知母、黃柏具有協(xié)同處方中溫補(bǔ)腎陽的淫羊藿、仙茅和巴戟天的作用，使其更好地調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能。知母皂苷能夠減輕去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失，促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和分化[3]。小檗堿是黃柏的主要成分，對于去卵巢和地塞米松誘導(dǎo)的骨丟失具有顯著的保護(hù)作用，能夠顯著抑制破骨細(xì)胞的形成、分化和骨吸收[3，7-8]。

應(yīng)用HPLC法可測定淫羊藿苷的含量，但是二仙湯作為中藥復(fù)方，其所含化學(xué)成分比單味藥材淫羊藿的成分復(fù)雜得多，也與含淫羊藿的其他中藥方劑不同[9]。本文通過優(yōu)化色譜條件，以甲醇-1%醋酸（60∶40，V/V）為流動相，在270 nm波長下檢測，取得了較好的分離效果，具有簡便迅速的優(yōu)點(diǎn)。

小檗堿屬于生物堿類成分，研究中考察了不同的流動相體系、三乙胺的用量及pH，最終確定流動相為甲醇-乙睛-0.3%三乙胺水溶液（20∶10∶70，V/V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0）時，可較好地解決色譜分離中的拖尾問題。

知母皂苷為二仙湯主要的皂苷類成分，由于該類成分沒有紫外吸收，《中國藥典》采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法測定知母皂苷BⅡ的含量，以控制知母藥材的質(zhì)量。也有文獻(xiàn)采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用測定知母皂苷類成分的含量[10-11]。這些方法對儀器要求較高，難以普及。知母皂苷元的主要成分為菝葜皂苷元，其能與香草醛發(fā)生顯色反應(yīng)，基于這一原理，可通過測定知母皂苷的水解產(chǎn)物菝葜皂苷元的含量，來測定知母皂苷的含量。本研究通過優(yōu)化皂苷水解時間、顯色反應(yīng)的溫度和時間，獲得了穩(wěn)定、可靠、簡便的二仙湯中知母皂苷類成分的含量測定方法。

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