炮制方法對中藥狗脊3種成分的影響Δ

趙敏杰，鞠成國，林桂梅，張 凡，賈天柱#（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制原理解析重點研究室，遼寧大連 116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600）

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz的干燥根莖，味苦、甘、性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、補肝腎、強腰膝的功效[1]。生狗脊以祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)為主；砂燙狗脊質(zhì)地疏松，便于粉碎和煎出有效成分，且易于除去殘存絨毛；蒸狗脊和酒狗脊、鹽狗脊具有增強“補肝腎、強腰膝”的作用[2]。本課題組前期對狗脊不同炮制品的藥效學(xué)作了大量的研究[3-7]，但尚未涉及這5種樣品水煎液中化學(xué)成分含量的變化情況。因此，本試驗同時對狗脊生品及其4種不同炮制品水煎液中水溶性總蛋白、總酚酸、總多糖的含量進行比較研究，以期闡明炮制對狗脊化學(xué)成分的影響，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

U-3010型紫外-可見分光光度計（日本日立公司）；電熱恒溫水浴鍋、101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）；AE240型十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-4型恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（上海予華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

D-無水葡萄糖（以下簡稱葡萄糖）對照品、原兒茶醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904、118010-201007，純度：＞98%）；牛血清白蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號：711J053，純度：＞98%）；考馬斯亮藍G250（以下簡稱考馬斯亮藍，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；苯酚、濃硫酸、乙醇、丙酮、乙醚均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

狗脊于2013年11月采自廣西河池，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz的根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 4種炮制品的制備

2.1.1 砂燙狗脊的制備 取凈河砂400 g，置于炒制容器內(nèi)，用武火加熱至180～190 ℃呈滑利狀態(tài)時，加入凈狗脊片50 g，不斷翻炒，6 min后取出[8]。

2.1.2 鹽狗脊的制備 取凈狗脊片50 g，加入含鹽量為1 g的鹽水40 ml，用保鮮膜密封，浸潤2 h，武火蒸制3 h，?；饜灊? h，取出干燥[9]。

2.1.3 酒狗脊的制備 取7.5 g黃酒，用清水稀釋至40 ml，加入50 g凈狗脊片中拌勻，用保鮮膜密封，浸潤2 h，放入鍋內(nèi)武火蒸制4 h，?；鸷髳灊? h，取出干燥[10]。

2.1.4 蒸狗脊的制備 取凈狗脊片50 g，加入清水40 ml并用保鮮膜密封，浸潤1 h，放入鍋內(nèi)武火蒸制4 h，?；饜灊? h，取出干燥[11]。

將生品及以上4種炮制品粉碎，過三號篩，備用。

2.2 水溶性總蛋白的含量測定[12]

2.2.1 考馬斯亮藍溶液的制備 精密稱取考馬斯亮藍100 mg，加入95%乙醇50 ml，溶液變?yōu)樗{色，再加入85%（W/V）磷酸溶液100 ml，此時溶液變成血紅色，最后用蒸餾水定容至1 000 ml，混勻。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取牛血清白蛋白0.010 05 g，用少量蒸餾水溶解，定容至100 ml，即得100.5 μg/ml的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4 ℃冰箱中保存）。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取狗脊生品及不同炮制品粉末各1 g，置于圓底燒瓶中，精密加入蒸餾水100 ml，稱質(zhì)量，加熱回流2 h，放涼后補足質(zhì)量。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備液100、200、300、400、500、600、800 μl，分別補加蒸餾水至1 ml，再分別加入5 ml考馬斯亮藍溶液，顯色5 min。以1 ml蒸餾水作空白，在400～800 nm波長處掃描，結(jié)果牛血清白蛋白在590 nm波長處有最大吸收。測定上述溶液在590 nm波長處的吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.007 6x+0.081 5（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，牛血清白蛋白檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10.05～80.40 μg/ml。

2.2.5 精密度試驗 取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1 ml，按“2.2.4”項下操作，連續(xù)測定6次。結(jié)果，吸光度的RSD＝0.56%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.6 顯色穩(wěn)定性試驗 取生狗脊供試品溶液，按“2.2.4”項下相關(guān)方法操作，每隔5 min測定1次吸光度，連續(xù)測定30 min。結(jié)果，吸光度的RSD＝3.23%（n＝7），表明供試品溶液中總蛋白在30 min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取生狗脊粉末6份，按“2.2.3”項下方法制備，按“2.2.4”項下方法測定其含量。結(jié)果，含量的RSD＝1.65%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的生狗脊粉末0.5 g，共6份，精密稱定，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，分別加入牛血清蛋白20.15 mg，然后按“2.2.4”項下方法測定含量，計算得總蛋白的平均回收率為101.1%（RSD＝3.52%，n＝6）。

2.3 總酚酸的含量測定[13]

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶醛對照品5.31 mg，置于50 ml量瓶中，加水使充分溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.106 2 mg/ml的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取狗脊生品及不同炮制品粉末各0.1 g，置于圓底燒瓶中，精密加入蒸餾水100 ml，稱質(zhì)量，加熱回流2 h，放涼后補足質(zhì)量。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取原兒茶醛對照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μl，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇至2 ml，加0.3%十二烷基硫酸鈉0.8 ml、0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）6]（1 ∶1）混合溶液0.4 ml，混勻，暗處放置5 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液至25 ml，搖勻，暗處放置20 min。蒸餾水平行做空白試驗。以原兒茶醛對照品溶液質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)，以760 nm波長處測定的吸光度（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y＝35 366x+0.175 7（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，原兒茶醛檢測質(zhì)量濃度線性范圍為5.31～63.72 μg/ml。

2.3.4 精密度試驗 取原兒茶醛對照品溶液0.5 ml，按“2.3.3”項下方法操作，連續(xù)測定6次。結(jié)果，吸光度的RSD＝0.45%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.5 顯色穩(wěn)定性試驗 取生狗脊供試品溶液，按“2.3.3”項下操作，每隔5 min測定1次吸光度，連續(xù)測定30 min。結(jié)果，吸光度的RSD＝4.36%（n＝7），表明狗脊供試品溶液中總酚酸類化合物在30 min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取生狗脊粉末6份，按“2.3.2”項下方法制備，按“2.3.3”項下方法測定其含量。結(jié)果，含量的RSD＝2.26%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 稱取已知含量的生狗脊粉末0.1 g，共6份，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別加入原兒茶醛對照品0.25 mg，按“2.3.3”項下方法測定含量，計算得總酚酸的平均回收率為99.6%（RSD＝2.97%，n＝6）。

2.4 總多糖的含量測定[14]

2.4.1 對照品溶液的制備 取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖約100 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加入適量水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得1.021 0 g/L的葡萄糖對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取狗脊生品及不同炮制品粉末各0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入100 ml 80%乙醇，加熱回流，每次1 h，至無色，抽濾。濾渣在常溫下?lián)]干，將濾渣連同濾紙置于圓底燒瓶中，加蒸餾水100 ml，加熱回流1 h，2次，趁熱濾過，用少量水洗滌濾器，合并濾液和洗液，放冷，移入250 ml量瓶中，稀釋至刻度，即得。

2.4.3 苯酚試液的制備 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g、碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾，182 ℃收集餾分。稱取該餾分5 g，置于100 ml量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，濾過并置于棕色瓶中，即得5%苯酚試液，備用。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，分別置于具塞刻度試管中，加水至1 ml，再分別加入5%苯酚溶液1 ml，混勻，加入濃硫酸5 ml，充分混勻。另取1.0 ml的蒸餾水同上操作，作為空白對照。將上述溶液置于沸水浴中反應(yīng)5 min，迅速放冷至室溫，在489 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖對照品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為y＝7 642.088x+0.154（r＝0.999 3）。結(jié)果表明，葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.051 1～0.613 mg/ml。

2.4.5 精密度試驗 取同一供試品溶液1.0 ml，按“2.4.4”項下方法，連續(xù)測定6次。結(jié)果，吸光度的RSD＝1.03%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.6 顯色穩(wěn)定性試驗 取生狗脊供試品溶液，按“2.4.4”項下方法操作，每隔5 min測定1次吸光度，連續(xù)測定30 min。結(jié)果，吸光度的RSD＝2.67%（n＝7），表明供試品溶液中總多糖在30 min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗 取生狗脊粉末6份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.4”項下方法測定，結(jié)果總多糖的平均含量為28.56%（RSD＝1.41%，n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的生狗脊粉末0.25 g，共6份，精密稱定，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，分別加入葡萄糖對照品71.4 mg，然后按“2.4.4”項下方法測定含量，計算得總多糖的平均回收率為99.3%（RSD＝3.56%，n＝6）。

2.5 含量測定結(jié)果

取狗脊生品及不同炮制品分別按照“2.2.3”“2.3.2”“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再分別按“2.2.4”“2.3.3”“2.4.4”項下方法測定吸光度，計算供試品中水溶性總蛋白、總酚酸和總多糖的含量，結(jié)果見表1。

表1 狗脊生品及其不同炮制品中水溶性總蛋白、總酚酸、總多糖含量測定結(jié)果（n＝6，%）Tab 1 Determination results of water-soluble total protein，total phenolic acid and total polysaccharides in crude C.barometz and different processed products（n＝6，%）

由表1結(jié)果可知，不同的炮制方法對狗脊中水溶性總蛋白、總酚酸、總多糖含量均有一定的影響，水溶性總蛋白的含量在炮制后均呈現(xiàn)一定程度的降低，總酚酸和總多糖的含量在炮制后均呈現(xiàn)一定程度的升高。

3 討論

本試驗首次考察了狗脊不同炮制品水煎液中水溶性總蛋白、總酚酸、總多糖的含量變化。炮制后水溶性總蛋白的含量均較生品有所下降，可能是由于加熱破壞了狗脊中的部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使其含量有所下降，但是含量降低后所致生物活性的變化尚不明確，有待進一步研究。酚酸類化合物是狗脊中重要的活性成分，《中國藥典》以原兒茶酸作為含量測定的指標(biāo)來評價藥材的質(zhì)量。狗脊中總酚酸的含量炮制后均有所增加，是由于炮制加熱致使糖苷鍵斷裂生成酚酸所致，故炮制后“補肝腎、強腰膝”作用的增強可能與總酚酸的含量增加有關(guān)[15]。多糖是中藥中普遍存在的一類化學(xué)成分，具有延緩衰老、提高免疫功能等多方面的補益藥理作用[16-18]，狗脊經(jīng)炮制后多糖含量的增加也符合制狗脊“補肝腎作用增強”的傳統(tǒng)炮制理論。但是狗脊發(fā)揮藥效的活性成分尚不能明確，故還有待進一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95.

[2]賈天柱.中藥炮制學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008：114.

[3]鞠成國，曹翠香，史琳，等.狗脊及其炮制品和狗脊毛的鎮(zhèn)痛、止血作用研究[J].中成藥，2005，27（11）：1 279.

[4]李軍，王振海，王春田，等.狗脊及其炮制品對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血液流變學(xué)的影響[J].中國中藥雜志，2008，33（17）：2 170.

[5]徐鋼，裴啟洋，鞠成國，等.CCK-8法檢測狗脊不同炮制品對成骨細胞的影響[J].中國中藥雜志，2013，38（24）：4 319.

[6]徐鋼，孫娜，趙敏杰，等.狗脊不同炮制品水煎液抗維甲酸致雄性大鼠骨質(zhì)疏松癥研究[J].中國中藥雜志，2014，39（6）：1 011.

[7]索天嬌，韓蕾，賈天柱.狗脊生、制品正丁醇提取物藥效學(xué)實驗研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14（10）：35.

[8]解世全，鞠成國，賈天柱.正交實驗優(yōu)選狗脊炮制工藝[C]//中華中醫(yī)藥學(xué)會第六屆中藥炮制學(xué)術(shù)會議論文集.淄博：中華中醫(yī)藥學(xué)會中藥炮制分會，山東鼎立中藥材科技有限公司，2006：3.

[9]藥政管理局.全國中藥炮制規(guī)范[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1988：71.

[10]徐鋼，鞠成國，周遠征，等.正交試驗優(yōu)選酒制狗脊的炮制工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：15.

[11]趙敏杰，徐鋼，鞠成國，等.狗脊蒸后切與切后蒸工藝的比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（19）：8.

[12]董潔，郭立瑋，文紅梅，等.中藥水提液中蛋白質(zhì)含量測定方法研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，23（6）：40.

[13]鞠成國，章琦，于海濤，等.不同產(chǎn)地生制狗脊中多糖的比較分析[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（24）：46.

[14]甄攀，肖金魚.吳茱萸及其炮制品中總酚酸含量測定[J].河北北方學(xué)院學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，26（5）：13.

[15]劉國欣，邢建國，李明春，等.香菇多糖對小鼠T淋巴細胞膜上離子通道基因表達的影響[J].中國藥房，2014，25（15）：1 361.

[16]許枬，賈天柱.燙狗脊炮制過程的化學(xué)反應(yīng)及產(chǎn)物研究[J].中國中藥雜志，2011，36（15）：2 066.

[17]曾祥海.山藥多糖對正常小鼠與實邪證模型小鼠免疫功能的影響[J].中國藥房，2014，25（23）：2 125.

[18]吳賢波，杜全宇，梁亞麗，等.黃芪多糖對肺氣虛模型小鼠免疫功能的影響[J].中國藥房，2012，23（47）：4 417.