正交設計優(yōu)選九味益胃合劑提取工藝研究

肖衛(wèi)紅，楊全偉，何 偉，張 耕（武漢市第一醫(yī)院，武漢 430022）

九味益胃合劑為武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院國家級重點專科脾胃病科的臨床處方，是在四君子湯合左金丸基礎上化裁而來，主要功能為益氣和胃、活血止痛，用于脾胃虛弱、血瘀胃痛、體倦神疲、噯腐吞酸、纏綿反復。臨床上使用后可提高潰瘍愈合質量，與三聯療法合用可提高幽門螺桿菌根除率[1]。該方主要由丹參、太子參、赤芍、姜黃連、大黃等9味中藥組成，故命名為九味益胃合劑。為了優(yōu)選其提取工藝，以最節(jié)省的成本來達到最優(yōu)提取效果，使其更好地發(fā)揮臨床療效，筆者以方中君藥丹參中水溶性成分丹酚酸B的含量、赤芍中芍藥苷的含量和干膏提取率進行加權評分作為綜合考察指標，設計L9（34）正交試驗，確定九味益胃合劑的最優(yōu)提取因素水平。試驗方法與結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A系列高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；e2695系列高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ME215S電子天平（瑞士Sartorius公司，實際分度值d＝0.01 mg）。

1.2 藥品、藥材與試劑

丹酚酸B對照品（批號：110715-201016，純度：95.4%）、芍藥苷對照品（批號：110736-201037，純度：95.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；丹參、太子參、赤芍、當歸、姜黃連、仙鶴草、紅花、茯苓、炙甘草（湖北天濟中藥飲片有限公司，批號：20130402）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 丹酚酸B的含量測定[2]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ODS Hypersil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-水-甲酸（7∶25∶67∶1，V/V/V/V），流速：1.0 ml/min；紫外檢測器檢測波長：286 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。

2.1.2 溶液制備（1）丹酚酸B對照品溶液。精密稱取丹酚酸B對照品13.94 mg，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇，制成每1 ml含0.278 8 mg的溶液即得。（2）供試品溶液。按比例稱取九味益胃合劑處方藥材，用10倍量的水浸泡1 h，水回流提取2次，每次提取1 h，收集所得藥液，濃縮至200 ml，搖勻；精密量取2 ml，置于50 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。（3）丹參陰性溶液。稱取不含丹參的其余藥材，按“（2）”項下供試品溶液制備方法制備即得。

2.1.3 方法專屬性試驗 吸取上述3種溶液各10μl，進樣檢測。結果，丹酚酸B對照品和供試品溶液均在18 min左右出現丹酚酸B色譜峰；供試品溶液色譜圖中丹酚酸B色譜峰峰形尖銳、對稱性好，與前后其他峰分離度均大于1.5；按丹酚酸B計，理論板數大于2 000，且陰性對照無干擾。色譜見圖1。

圖1 丹酚酸B高效液相色譜圖A.丹酚酸B對照品溶液；B.供試品溶液；C.丹參陰性溶液；1.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatograms of salvianoli acid BA.control solution of salvianoli acid B；B.test solution；C.negative solution of Salvia miltiorrhiza；1.salvianoli acid B

2.1.4 線性關系考察 取丹酚酸B對照品溶液，精密取2、3、4、5、10 ml分別至20 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。取上述稀釋后溶液及母液分別進樣10 μl，測定峰面積（y），以y與對照品質量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程為y＝11 143x－23 229（r＝0.999 9）。結果表明，丹酚酸B檢測質量濃度線性范圍為27.88～278.80 μg/ml。

2.1.5 精密度試驗 精密取丹酚酸B對照品溶液10 ml置于20 ml量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；連續(xù)進樣6次，計算峰面積的RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液分別于制備后0、1、2、4、8、12 h進樣測定峰面積，得峰面積的RSD＝0.49%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，測定丹酚酸B的含量。結果平均含量為1.966 4 mg/ml（RSD＝0.83%，n＝6），表明本法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品6份，制備成供試品溶液后精密量取1 ml，分別置于50 ml量瓶中，各精密加入適量的丹酚酸B對照品，加75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液分別進樣、測定并計算回收率。結果平均回收率為97.54%（RSD＝1.85%，n＝6）。

2.2 芍藥苷的含量測定[2]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ODS Hypersil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14 ∶86，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2.2 溶液制備（1）芍藥苷對照品溶液。精密稱取芍藥苷對照品適量，加稀乙醇使溶解，制成每1 ml含0.616 mg的溶液即得。（2）供試品溶液[3]。按比例稱取九味益胃合劑處方藥材，用10倍量的水浸泡1 h，水回流提取2次，每次提取1 h，收集所得藥液，濃縮至200 ml，搖勻；精密取3 ml，置于25 ml量瓶中，加稀乙醇適量，超聲處理（功率：240 W，頻率：45 kHz）30 min后取出，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。（3）赤芍陰性溶液。按處方比例稱取缺赤芍藥材，按“（2）”項下供試品溶液制備方法制備即得。

2.2.3 方法專屬性試驗 精密吸取上述3種溶液各10μl進樣檢測。結果，芍藥苷對照品溶液和供試品溶液均在9 min左右出現芍藥苷色譜峰；供試品溶液色譜圖中芍藥苷色譜峰峰形尖銳、對稱性好，與前后其他峰分離度均大于1.5；按芍藥苷計，理論板數大于2 000，且赤芍陰性溶液無干擾。色譜見圖2。

圖2 芍藥苷高效液相色譜圖A.芍藥苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.赤芍陰性溶液；1.芍藥苷Fig 2 HPLC chromatograms of paeoniflorinA.control solution of paeoniflorin；B.test solution；C.negative solution of Paeonia Radix Rubra；1.paeoniflorin

2.2.4 線性關系考察 精密取已制備的各質量濃度的芍藥苷對照品溶液（24、36、48、60、180 μg/ml）分別進樣10 μl，測定峰面積（y），以y與對照品質量濃度（x）進行線性回歸，得回歸方程為y＝24 014x+57 187（r＝0.999 3）。結果表明，芍藥苷檢測質量濃度線性范圍為24.64～172.48 μg/ml。

2.2.5 精密度試驗 精密取對照品溶液10 ml至20 ml量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻。連續(xù)進樣6次，記算芍藥苷峰面積RSD＝1.21%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液分別于制備后0、1、2、4、8、12 h時進樣10 μl，測定峰面積，計算得芍藥苷峰面積的RSD＝1.46%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，測定芍藥苷的含量。結果其平均含量為0.310 mg/ml（RSD＝0.95%，n＝6），表明本法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品6份，制備成供試品溶液。精密量取1 ml，分別置于50 ml量瓶中，各精密加入適量的丹酚酸B對照品，加75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液分別進樣、測定并計算回收率。結果平均回收率為100.27%（RSD＝1.04%，n＝6）。

2.3 正交試驗

[4-6]及預試驗基礎上，針對藥材的加水倍量、提取時間、浸泡時間、提取次數等4個影響因素，以丹酚酸B含量、芍藥苷含量為主要評價指標，設計L9（34）正交試驗；以干膏得率（干膏總質量/藥材總質量×100%）為次要指標，權重系數按丹酚酸B含量、芍藥苷含量、干膏得率分別為40、40、20來計算綜合評分，即綜合評分＝（丹酚酸B含量/丹酚酸B含量最大值）×100×40%+（芍藥苷含量/芍藥苷含量最大值）×100×40%+（干膏得率/干膏得率最大值）×100×20%。

稱取處方比例的藥材共9份，每份121.5 g，按表1因素與水平安排試驗，藥材加適量水浸泡、煎煮一定時間后合并提取液，過濾濃縮至200 ml，得藥液后檢測各項指標。因素與水平見表1；正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

通過綜合評分直觀分析，4個因素對丹酚酸B含量、芍藥苷含量、干膏得率的影響程度不同，因素C＞D＞A＞B，最優(yōu)工藝為A3B1C2D3。根據方差分析結果可知，因素C、D對綜合評分均有顯著性影響，但由于提取2次與3次對試驗結果影響不大，結合生產實際，從節(jié)約成本方面綜合考慮后，最終確定最優(yōu)工藝為A2B1C2D2，即加8倍量藥材水浸泡1 h，提取2次，每次1 h。根據最優(yōu)工藝進行提取，3批樣品驗證試驗結果表明綜合評分的RSD＜2%（n＝3），表明提取工藝穩(wěn)定，詳見表4。

3 討論

表4 驗證試驗結果Tab 4 Results of verification test

采用單一考察指標優(yōu)選中藥提取工藝并不全面，因單一指標并不能完全代表中藥制劑整體質量的優(yōu)劣[7]。丹參所含水溶性丹酚酸類成分在抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、調血脂和細胞保護方面作用顯著[8-9]；而赤芍中的芍藥苷為其主要有效成分之一，具有活血化瘀、通脈、抗凝、抗炎、抗過敏藥效作用[10]，這與該處方的功能主治相一致。故以丹酚酸B與芍藥苷的含量作為丹參和赤芍提取效率的考察指標，比較符合中醫(yī)臨床用藥的習慣以及質量控制的要求。

本研究所建立的丹酚酸B和芍藥苷的高效液相色譜含量測定方法，經過全面的系統適用性試驗和方法學考察，具有分離度好、專屬性強、穩(wěn)定性好、結果準確的特點，為正交試驗優(yōu)選丹酚酸B、芍藥苷水回流提取工藝條件提供了可靠保障。本試驗所確定的九味益胃合劑的優(yōu)選提取工藝，具有提取率較高、操作簡單、便于進行大生產的特點，且其批間質量穩(wěn)定，故可作為九味益胃合劑的提取工藝方法。

參考文獻

[1]徐州，周德端，段國勛，等.中藥對幽門螺桿菌抑殺作用的實驗研究[J].中國醫(yī)藥學報，1993，8（5）：25.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：70-71、147-148.

[3]鄭立運，劉穎，于書儀，等.赤芍中芍藥苷提取溶媒的選擇[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2007，30（4）：84.

[4]張昀，劉路，李欽.丹參中丹酚酸B的提取工藝研究[J].中草藥，2007，38（8）：1 193.

[5]聶繼紅，周玲.復方中丹參提取工藝及含量測定的研究[J].中成藥，2007，29（6）：889.

[6]彭曉霞，路莎莎，張振巍.混合均勻設計效應面法優(yōu)選赤芍中芍藥苷的提取工藝[J].中國藥房，2011，22（11）：994.

[7]朱建新，王宏，何薇.清熱除濕顆粒提取工藝研究[J].中成藥，2012，34（5）：979.

[8]劉建梅，朱明磊，郭鄂平.丹酚酸B的研究概況[J].醫(yī)學理論與實踐，2014，27（2）：166.

[9]王蓉，原永芳.丹酚酸B藥理作用的研究概況[J].中醫(yī)藥導報，2011，17（4）：130.

[10]冀蘭鑫，黃浩，李長志，等.赤芍藥理作用的研究進展[J].藥物評價研究，2010，33（3）：233.