褐藻素誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的自噬作用機制研究

廖政邦，于五輩，趙 輝#（1.東莞市第五人民醫(yī)院，廣東東莞 53900；.河南大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)研究所，河南開封 475004）

宮頸癌是病死率最高的常見婦科腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性健康。復(fù)發(fā)的宮頸癌往往對臨床常用的抗腫瘤藥物耐藥，因此亟需開發(fā)以新方式引起腫瘤細(xì)胞死亡的藥物以克服耐藥[1]。自噬是繼凋亡和壞死后發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞死亡形式，雖然細(xì)胞通過自噬可以降解受損、衰老和失去功能的大分子或細(xì)胞器，維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但自噬的過度激活又會損傷細(xì)胞器，促進自噬性細(xì)胞死亡。近年來發(fā)現(xiàn)很多藥物可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬產(chǎn)生抗腫瘤作用，例如維生素K3可通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑介導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬[2]；麥冬皂苷B通過抑制蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又稱Akt）、哺乳動物雷帕雷素靶蛋白（mTOR）通路介導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬[3]。以上研究表明，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生自噬是研發(fā)抗腫瘤藥物的一種有效策略[4]。

褐藻素（Fucoxanthin）是一種具有獨特結(jié)構(gòu)的海洋類胡蘿卜素成分，具有消痰、軟堅散結(jié)、利水作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，褐藻素具有抗腫瘤、促凋亡、抗炎及清除自由基等藥理作用。已有研究表明，褐藻素可通過抑制Akt、mTOR的磷酸化來誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[5]。由于藥物抗腫瘤作用機制往往取決于腫瘤類型，因而褐藻素是否對宮頸癌具有抗腫瘤作用尚不得而知，本研究對褐藻素抗宮頸癌作用及其分子機制進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；DMI3000B型倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司）；Multiskan Spectrum型全波長酶標(biāo)儀（美國熱電公司）。

1.2 藥品與試劑

胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司）；褐藻素（純度：98.0%）、洛霉素A1（Baf A1，純度：98.0%）、新雷素（純度：＞98%）、氯化銨（NH4Cl）、MTT、核糖核酸酶（RNase）A、吖啶橙、3-甲基腺嘌呤（3-MA，純度：98.0%）、U0126（純度：98.0%）、碘化丙啶、一抗均購自美國Sigma公司；細(xì)胞裂解液試劑盒、Lyso-Tracker Red、Hoechst33342、AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Akt一抗、phospho-Akt（p-Akt）一抗、p21一抗、CDK2一抗、Cyclin D1一抗、Phospho-p70S6 kinase（p-p70S6K，Thr389）一抗、PTEN一抗、Phospho-mTOR（p-mTOR）一抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；Beclin-1、LC3及相應(yīng)二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 細(xì)胞

HeLa細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)[5]

細(xì)胞凍存液清洗后，加入RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞抑制率測定

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁。以1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素，1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素+3-MA（5 mmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞48 h。于試驗終止前4 h每孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl，37 ℃下繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。每孔加入二甲基亞砜100 μl，37 ℃下振蕩30 min后，以酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定光密度（OD），以O(shè)D代表細(xì)胞活力并計算細(xì)胞抑制率與半數(shù)抑制濃度（IC50）[5]。

2.3 細(xì)胞周期與凋亡測定

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁。以0（空白對照）、10、20、40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h。同一濃度重復(fù)3孔。培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)束后以70%冰冷乙醇固定過夜，RNase A（50 μg/ml）處理后碘化丙啶（100 g/ml）避光染色，以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布；培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)束后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書處理細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率[5]。

2.4 細(xì)胞自噬測定（自噬劑：3-MA）

2.4.1 吖啶橙染色法 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5 000個/孔細(xì)胞接種于6孔板，以40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基。同一濃度重復(fù)3孔。吖啶橙（1 mg/ml）避光染色15 min，熒光顯微鏡觀察并拍照，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)酸性小囊泡增多時吖啶橙由綠色熒光轉(zhuǎn)變成紅色熒光。自噬抑制性試驗則加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞2 h后，再加入40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基，染色方法同上[6]。試驗設(shè)空白對照（0 μmol/L）。

2.4.2 Lyso-Tracker Red染色法 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5 000個/孔細(xì)胞接種于6孔板，以40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基。同一濃度重復(fù)3孔。加入Lyso-Tracker Red（50 nmol/L）37 ℃避光染色45 min，Hoechst 33342（1 μmol/L）復(fù)染15 min，熒光顯微鏡觀察并拍照，當(dāng)溶酶體數(shù)量增加時紅色熒光增強。自噬抑制性試驗則加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞2 h后再加入40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基，染色方法同上[6]。試驗設(shè)空白對照（0 μmol/L）。

2.4.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa-GFP-LC3細(xì)胞測試法 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞2 h，進行pGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用新霉素篩選細(xì)胞克隆。收獲HeLa-GFP-LC3細(xì)胞以5 000個/孔接種于6孔板，40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。細(xì)胞內(nèi)綠色熒光呈點狀分布則說明細(xì)胞發(fā)生自噬，反之呈彌散性綠色熒光。對于自噬抑制性試驗則為加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞2 h后再加入40 μ mol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄去培養(yǎng)基，染色方法同上[7]。試驗設(shè)空白對照（0 μmol/L）。

2.5 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的測定

以Western blot法測定蛋白表達。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁，單獨加入40 μmol/L褐藻素或者先加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）或U0126（10 μmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞2 h后再加入40 μmol/L褐藻素，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，PBS洗3次，以離心半徑為13.5 cm、1 000 r/min離心5 min后用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。同一濃度重復(fù)3孔。蛋白定量后取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。8%聚丙烯酰胺-十二烷基磺酸鈉（SDS）凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后依次加入相應(yīng)的一抗和二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min。凝膠成像系統(tǒng)分析細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白條帶[5]。試驗設(shè)空白對照（0 μmol/L）。

2.6 自噬流量測定

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁。單獨加入10 μmol/L褐藻素或先加入自噬抑制劑Baf A1或NH4Cl后，再加入10 μmol/L褐藻素，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，測定LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、p62表達水平。對于溶酶體內(nèi)Cathepsin D檢測，則分別加入10、20、40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，PBS洗3次，以離心半徑為13.5 cm、1 000 r/min離心5 min，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，測定Cathepsin D表達水平。同一濃度重復(fù)3孔。蛋白定量后取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。8%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后依次加入相應(yīng)的一抗和二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min。凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶[5]。試驗設(shè)空白對照（0 μmol/L）。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)均為計量資料，以表示，采用t檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞抑制率測定結(jié)果

1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞生長具有明顯抑制作用，且呈濃度依賴關(guān)系，IC50為（55.1±7.6）μmol/L。細(xì)胞抑制率測定結(jié)果見表1。

表1 細(xì)胞抑制率測定結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Determination results of cell inhibition rate（，n＝3）

表1 細(xì)胞抑制率測定結(jié)果（，n＝3）Tab 1 Determination results of cell inhibition rate（，n＝3）

3.2 細(xì)胞周期與凋亡測定結(jié)果

與空白對照比較，10、20、40 μmol/L褐藻素培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，可劑量依賴性地阻滯細(xì)胞于G0/G1期，但對細(xì)胞凋亡無顯著影響。細(xì)胞周期與凋亡測定結(jié)果見表2。

表2 細(xì)胞周期與凋亡測定結(jié)果Tab 2 Determination results of cell cycle and apoptosis

3.3 細(xì)胞自噬測定結(jié)果

吖啶橙染色結(jié)果表明，經(jīng)40 μmol/L褐藻素處理48 h后，HeLa細(xì)胞內(nèi)紅色熒光明顯增強，提示細(xì)胞內(nèi)的酸性小囊泡增多；Lyso-Tracker Red染色結(jié)果進一步提示褐藻素可誘導(dǎo)溶酶體數(shù)量的增多及活性的增強；HeLa-GFP-LC3細(xì)胞內(nèi)點狀綠色熒光明顯增多，而空白對照細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)彌散性綠色熒光。細(xì)胞自噬測定結(jié)果見圖1。

圖1 細(xì)胞自噬與相關(guān)蛋白測定結(jié)果（×20）A.吖啶橙染色；B.LysoTracker Red染色；C.HeLa-GFP-LC3細(xì)胞測試法；D.Beclin-1和LC3Ⅰ、LCⅡ表達；E.p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、Cyclin D1、CDK2、PTEN、p21表達Fig 1 Determination results of autophagy and related protein（s×20）A.acridine orange staining；B.LysoTracker Red staining；C.HeLa-GFPLC3 cell method；D.Beclin-1 and LC3Ⅰ，LCⅡexpression；E.p-Akt，p-mTOR，p-p70S6K，Cyclin D1，CDK2，PTEN，p21 expression

3.4 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的測定結(jié)果

40 μmol/L褐藻素可增強自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1的表達，可促進LC3 Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3 Ⅱ，提示褐藻素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了自噬。與空白對照比較，40 μmol/L褐藻素作用細(xì)胞48 h后，p-Akt及其下游靶蛋白p70S6K和p-mTOR表達減弱，總Akt蛋白表達并無明顯改變；Akt信號通路的負(fù)調(diào)控蛋白PTEN表達增強，提示褐藻素通過Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生了自噬。與空白對照比較，40 μmol/L褐藻素可抑制CDK2、Cyclin D1蛋白表達，增強p21蛋白表達。自噬抑制劑3-MA幾乎完全逆轉(zhuǎn)褐藻素對HeLa細(xì)胞的生長抑制作用，但對細(xì)胞凋亡無明顯影響，提示褐藻素的生長抑制作用取決于自噬的發(fā)生。此外，3-MA部分逆轉(zhuǎn)褐藻素對自噬相關(guān)蛋白表達的調(diào)控。細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的測定結(jié)果（自噬劑：3-MA）見圖1。

3.5 細(xì)胞自噬流量測定結(jié)果

自噬的發(fā)生是一個連續(xù)的動態(tài)過程，自噬流量的檢測能反映該過程。Baf A1是囊泡H+ATPases特異性抑制劑，可抑制酸性溶酶體和自噬體/溶酶體的形成。結(jié)果顯示Baf A1可明顯增加褐藻素誘導(dǎo)的LC3 Ⅱ蛋白的表達。NH4Cl通過抑制溶酶體酸化可以抑制自噬底物的降解，結(jié)果顯示NH4Cl明顯逆轉(zhuǎn)了褐藻素誘導(dǎo)的p62表達降低。此外，褐藻素濃度依賴性地誘導(dǎo)分布在溶酶體內(nèi)Cathepsin D表達上調(diào)。細(xì)胞自噬流量測定結(jié)果（自噬劑：Baf A1或NH4Cl）見圖2。

3.4 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白測定結(jié)果（自噬劑：U0126）

綜合上述試驗可知，自噬發(fā)生的分子機制涉及多種信號通路。由于3-MA并不完全抑制褐藻素對AKT/mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白的調(diào)控，提示可能有其他信號通路參與褐藻素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。經(jīng)過篩選，筆者發(fā)現(xiàn)褐藻素活化MEK/ERK信號通路，而MEK抑制劑U0126不僅可以抑制MEK/ERK信號通路的活化，而且可以部分逆轉(zhuǎn)褐藻素誘導(dǎo)的Beclin-1表達增強及LC3 Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3 Ⅱ，提示MEK/ERK信號通路也參與了褐藻素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白測定結(jié)果（自噬劑：U0126）見圖3。

圖2 細(xì)胞自噬流量測定結(jié)果（自噬劑：Baf A1或NH4Cl）A.褐藻素+Baf A1；B.褐藻素+NH4Cl；C.褐藻素Fig 2 Determination results of autophagy flow of cell（sautophagy agent：Baf A1 or NH4Cl）A.fucoidan+Baf A1；B.fucoxanthin+NH4Cl；C.fucoxanthin

圖3 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白測定結(jié)果（自噬劑：U0126）Fig 3 Determination results of autophagy related proteins（autophagy agent：U0126）

4 討論

自噬在腫瘤化療中的作用目前仍未完全闡明，腫瘤細(xì)胞通過發(fā)生自噬得以存活并對抗藥物的治療作用，抑制自噬可以促進細(xì)胞凋亡，而一些抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬從而產(chǎn)生治療作用[8]。本研究表明，褐藻素的抗HeLa細(xì)胞增殖作用幾乎完全被自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn)，說明其抗增殖作用是通過自噬產(chǎn)生的。此外，褐藻素并不誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與以前的研究結(jié)果不同：褐藻素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞同時發(fā)生自噬和凋亡，且自噬是抑制凋亡[5]。以上結(jié)果提示褐藻素可通過不同的機制產(chǎn)生抗腫瘤作用，具有腫瘤細(xì)胞特異性。

自噬的發(fā)生是一個動態(tài)的連續(xù)過程，待降解物質(zhì)由雙層膜包裹而形成自噬體，隨后與溶酶體融合并形成自噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的酸性水解酶消化水解待降解物質(zhì)并釋放回細(xì)胞質(zhì)中，從而實現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)利用[9]。褐藻素引起HeLa細(xì)胞內(nèi)吖啶橙的紅色熒光和Lyso-Tracker Red的紅色熒光增強，提示褐藻素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生了自噬。此外，Beclin-1表達增加、LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ和HeLa-GFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗均進一步證實褐藻素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生了自噬。

Akt/mTOR信號通路往往參與細(xì)胞自噬的發(fā)生[10]。研究結(jié)果表明，褐藻素能明顯調(diào)控Akt/mTOR信號通路中一些關(guān)鍵蛋白，如Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化以及上調(diào)PTEN（Akt/mTOR信號通路的負(fù)調(diào)控蛋白）的表達，提示褐藻素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生的自噬是通過抑制該信號通路中關(guān)鍵蛋白的活化產(chǎn)生的。由于3-MA并不完全抑制褐藻素對Akt/mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白的調(diào)控，提示可能有其他信號通路參與褐藻素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)，褐藻素通過使MEK1/2和ERK1/2磷酸化從而活化MEK/ERK信號通路，進一步研究表明MEK抑制劑U0126不僅可以抑制MEK/ERK信號通路的活化，而且可以部分逆轉(zhuǎn)褐藻素誘導(dǎo)的Beclin-1表達增加及LC3 Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)長C3 Ⅱ，提示MEK/ERK信號通路也參與了褐藻素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，即褐藻素通過抑制AKT/mTOR信號通路和激活MEK/ERK信號通路共同介導(dǎo)了HeLa細(xì)胞的自噬。此外，褐藻素是通過抑制p53、CDK2、Cyclin D1的表達以及促進p21的表達從而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。實驗結(jié)果表明，褐藻素可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬和細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，但并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。預(yù)孵自噬抑制劑3-MA后，褐藻素抗增殖作用被逆轉(zhuǎn)，提示褐藻素抗HeLa細(xì)胞的作用取決于自噬，進一步研究表明褐藻素是通過抑制Akt信號通路以及激活MEK/ERK信號通路誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬。

本研究進一步完善了褐藻素抗腫瘤作用的分子機制，并為其應(yīng)用于臨床提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

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