參麥注射液聯(lián)用低分子肝素鈣后在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征研究

王鵬，薛清丹，鞠愛(ài)霞，康宇紅，李秋紅

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

心腦血管疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單用一種藥物進(jìn)行治療難以收到滿意效果，臨床目前主要采用藥物聯(lián)用的治療方法。隨著中西醫(yī)結(jié)合的深入開(kāi)展，加之心腦血管疾病病因復(fù)雜，常采用反應(yīng)較快、針對(duì)性強(qiáng)的西藥與作用緩和持久的中藥聯(lián)合治療方針，中西藥聯(lián)合用藥方法表現(xiàn)出了獨(dú)特的療效和強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)［1-2］。參麥注射液是由人參、麥門冬組成的中藥制劑，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈的功效，臨床用于心腦血管疾病、免疫力低下、腫瘤及各種慢性疾病的輔助治療［3-5］。近幾年隨著中西聯(lián)合用藥情況的普遍發(fā)展［6-9］，參麥注射液與其他西藥聯(lián)合用藥治療心腦血管疾病情況越來(lái)越多，且療效顯著［10-14］，其中以抗凝類的低分子肝素鈣與參麥注射液聯(lián)用情況最多。然而聯(lián)合應(yīng)用的理論基礎(chǔ)在國(guó)內(nèi)外尚未有較深入的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)以人參皂苷Rg1、Re、Rb1作為參麥注射液的指標(biāo)成分，研究單獨(dú)用藥及與低分子肝素鈣聯(lián)用后參麥注射液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，從藥動(dòng)學(xué)角度觀察中西藥聯(lián)合用藥后西藥對(duì)中藥體內(nèi)過(guò)程的影響，為臨床上參麥注射液與西藥合理聯(lián)合應(yīng)用且療效增強(qiáng)的機(jī)制探討提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110703-200726、110754-200822、110704-200921);參麥注射液(神威藥業(yè)有限公司，批號(hào)11122721);低分子肝素鈣注射液(兆科藥業(yè)有限公司，批號(hào)01070012);甲醇(Dikma試劑公司，批號(hào)70242，色譜純);乙腈(Tedia試劑公司，批號(hào)1110410，色譜純);其他試劑均為分析純;水為超純水。

1.2 儀器

高效液相色譜儀(LC-2010A，日本島津);旋渦混合器(XW-80A，上海);低速臺(tái)式離心機(jī)(TDL-60B，上海);超聲波清洗器(SK8200H，上海);微量移液器(GILSON，法國(guó));電子天枰(AR2140，上海);高速冷凍離心機(jī)(TGL16M，長(zhǎng)沙)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量180～250g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(黑)2008-001)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil(R)C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，大連物理化學(xué)研究所;流動(dòng)相:乙腈-水(0～30min，20:80遞變至22:78;30～35min，22:78;35～60min，22:78遞變至40:60);流速:1.0mL/min;柱溫:20℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203nm;進(jìn)樣量:20μL。

2.2 溶液的制備

分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，甲醇溶解，配成1.0mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液;另精密取內(nèi)標(biāo)大豆苷元對(duì)照品適量，甲醇溶解，配成1.0mg/mL儲(chǔ)備液。

2.3 生物樣品處理

吸取血漿樣品150μL置于1.5mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL，加入400μL乙腈，渦旋混合3min，14000r/min低溫離心10min，取450μL上清液于40℃氮?dú)獯蹈?，而后?00μL 20%的乙腈-水溶液進(jìn)行復(fù)溶，渦旋混合1min，14000r/min低溫離心5min，取20μL上清液進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

給藥后的血漿樣品，按“生物樣品處理”項(xiàng)操作后進(jìn)樣。結(jié)果表明血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)均不干擾，本方法的專屬性符合要求。

圖1 給藥后血漿樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1及大豆苷元生物樣品色譜圖

2.4.2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿，分別精密加入人參皂苷Rg1、Re、Rb1標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量。配制人參皂苷Rg1、Re、Rb1血漿標(biāo)準(zhǔn)系列。按“生物樣品處理”項(xiàng)操作，分別以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值y對(duì)樣品濃度x進(jìn)行線性回歸，得到人參皂苷Rg1、Re、Rb1血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍為分別為:y=0.0018x-0.002，r=0.9996，1.0～30.0μg/mL;y=0.0012x+0.0005，r=0.9996，0.5～15.0μg/mL;y=0.0014x-0.0004，r=0.9995，0.5～200.0μg/mL。

2.4.3 人參皂苷Rg1、Re、Rb1的精密度與相對(duì)回收率

分別配制高、中、低濃度的人參皂苷Rg1、Re、Rb1血漿QC樣品。按“生物樣品處理”項(xiàng)操作，進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明該方法的回收率符合要求，人參皂苷Rg1日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于5%;人參皂苷Re、Rb1日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于10%。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

分別配制高、中、低濃度的人參皂苷Rg1、Re、Rb1血漿QC樣品，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1血漿樣品室溫穩(wěn)定保存12h及冷凍保存30天穩(wěn)定性良好(RSD＜5%)。

2.5 藥動(dòng)學(xué)研究

Wistar大鼠12只，隨機(jī)分成2組。分別為參麥注射液?jiǎn)为?dú)組(9.00mL/kg，尾靜脈注射);低分子肝素鈣注射液(1.44mL/kg，皮下注射)+參麥注射液聯(lián)合組;各組大鼠均于給藥前和給藥后5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、6h、12h、24h、48h、96h、144h眼靜脈采集血液樣品300μL置肝素化的試管中，3000r/min離心，分離血漿，-20℃保存待測(cè)。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用DAS 2.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)12只健康大鼠服藥后各時(shí)間點(diǎn)的血漿藥物濃度進(jìn)行分析，用統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算各項(xiàng)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并采用SPSS 18.0對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 低分子肝素鈣對(duì)人參皂苷Rg1、Re、Rb1在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

2.7.1 聯(lián)合用藥對(duì)人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

單獨(dú)及聯(lián)合低分子肝素鈣給藥后人參皂苷Rg1的血藥濃度-時(shí)間曲線(圖2)，相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。參麥注射液與低分子肝素鈣聯(lián)用后人參皂苷Rg1的血藥濃度均升高，顯示出了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;聯(lián)合低分子肝素鈣后人參皂苷Rg1的CL降低，MRT延長(zhǎng)，AUC(0-144)和AUC(0-∞)均顯著升高。

表1 聯(lián)合低分子肝素鈣用藥后人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，)

表1 聯(lián)合低分子肝素鈣用藥后人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，)

注:與單獨(dú)給藥組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

Parameter SMI SMIwith LMWH Ke(h-1)2.452±0.799 2.477±0.205 CL(mL/h) 0.332±0.042 0.279±0.016*t1/2(h) 0.305±0.086 0.388±0.010 MRT(h) 0.944±0.010 0.956±0.004*AUC(0-144)(μg·h/mL) 26.630±3.093 30.230±1.196*AUC(0-∞)(μg·h/mL) 27.432±3.092 32.044±1.096*

2.7.2 聯(lián)合用藥對(duì)人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

圖2 單用及聯(lián)用低分子肝素鈣后人參皂苷Rg1在大鼠體內(nèi)的血漿藥-時(shí)曲線(n=6，)

單獨(dú)及聯(lián)合低分子肝素鈣給藥后人參皂苷Re的血藥濃度-時(shí)間曲線(圖3)，相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。單獨(dú)及聯(lián)用低分子肝素鈣注射液后人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)的血藥濃度變化趨勢(shì)基本一致，無(wú)顯著性差異，人參皂苷Re的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)沒(méi)有顯著性變化。

圖3 單用及聯(lián)用低分子肝素鈣后人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)的血漿藥-時(shí)曲線(n=6，)

表2 聯(lián)合低分子肝素鈣用藥后人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，)

表2 聯(lián)合低分子肝素鈣用藥后人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，)

Parameter SMI SMIwith LMWH Ke(h-1)1.491±0.081 1.489±0.210 CL(mL/h) 1.092±0.022 1.074±0.097 t1/2(h) 0.466±0.025 0.473±0.069 MRT(h) 0.924±0.005 0.928±0.013 AUC(0-144)(μg·h/mL) 7.622±0.131 7.940±0.706 AUC(0-∞)(μg·h/mL)8.245±0.164 8.558±0.707

2.7.3 聯(lián)合用藥對(duì)人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

單獨(dú)及聯(lián)合低分子肝素鈣給藥后人參皂苷Rb1的血藥濃度-時(shí)間曲線(圖4)，相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。參麥注射液聯(lián)用低分子肝素鈣后人參皂苷Rb1血藥濃度顯著升高(P＜0.01)。人參皂苷Rb1的Ke降低，MRT延長(zhǎng)，CL降低，t1/2延長(zhǎng)，AUC(0-144)和AUC(0-∞)均顯著升高(P＜0.01)。

圖4 單用及聯(lián)用低分子肝素鈣后人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的血漿藥-時(shí)曲線(n=6，)

表3 聯(lián)合低分子肝素鈣用藥后人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，)

表3 聯(lián)合低分子肝素鈣用藥后人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6，)

注:與單獨(dú)給藥組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

Parameter SMI SMIwith LMWH Ke(h-1) 0.016±0.001 0.015±0.001*CL(mL/h) 0.005±0.001 0.004±0.001＊＊t1/2(h) 42.871±2.255 46.283±2.191*MRT(h) 0.871±0.008 0.879±0.009＊＊AUC(0-144)［μg/(mL·h)］2639.834±26.660 2949.229±44.420＊＊AUC(0-∞)［μg/(mL·h)］3030.592±18.346 3354.738±26.035＊＊

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究低分子肝素鈣對(duì)參麥注射液在大鼠體內(nèi)過(guò)程的影響，從藥動(dòng)學(xué)角度探討中西藥聯(lián)合使用時(shí)西藥對(duì)中藥體內(nèi)過(guò)程的影響。與低分子肝素鈣聯(lián)合用藥后，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的血藥濃度均顯著升高，且顯著影響了其MRT、CL、AUC(0-144)、AUC(0-∞)等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。據(jù)報(bào)道參麥注射液與低分子肝素鈣聯(lián)用對(duì)不穩(wěn)定性心絞痛、肺源性心臟病心力衰竭等心血管疾病產(chǎn)生了較好的治療效果［10-14］?？赡芘c低分子肝素鈣明顯增加了人參皂苷Rg1和Rb1在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)停留時(shí)間，降低其清除率，提高藥物體內(nèi)含量，增強(qiáng)了人參皂苷Rg1和Rb1對(duì)心血管的有關(guān)藥理作用［15］，從而藥物聯(lián)用后藥效增強(qiáng)。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的HPLC法，經(jīng)方法學(xué)考察表明，本測(cè)定方法線性關(guān)系良好，樣品測(cè)定不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾。特異性、靈敏度、精密度、回收率、穩(wěn)定性均符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則要求，本方法可滿足對(duì)人參皂苷Rg1、Re、Rb1的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究的檢測(cè)方法要求。首次探明低分子肝素鈣對(duì)參麥注射液體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響，從藥動(dòng)學(xué)角度驗(yàn)證了臨床上藥物合用療效增加的結(jié)果，為臨床上中西藥更廣泛更合理的聯(lián)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，使中西藥聯(lián)用發(fā)揮更可靠更有效的治療效果。

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