丹參酮ⅡA磺酸鈉在低氧下對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和促纖維化因子表達(dá)的影響*

康春福 陳 斌 秦澤蓮 孫 艷 李艷芳 于東寧 安 陽(yáng) 畢洪森

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100191)

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·基礎(chǔ)研究·

丹參酮ⅡA磺酸鈉在低氧下對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和促纖維化因子表達(dá)的影響*

康春福 陳 斌 秦澤蓮**孫 艷①李艷芳①于東寧②安 陽(yáng) 畢洪森

(北京大學(xué)第三醫(yī)院成形外科，北京 100191)

目的 研究常氧和低氧下，丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts, KFs)增殖和促纖維化因子表達(dá)的影響，探討STS治療瘢痕疙瘩的可能作用。 方法 原代培養(yǎng)5例KFs，將細(xì)胞分組，分別在常氧(21%O2)和低氧(2%O2)下用不同劑量的STS(0、50、100、200、400、800 μmol/L)干預(yù)48 h，采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，同時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。用不同劑量的STS(0、100、200 μmol/L)同樣干預(yù)48 h，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成骨細(xì)胞特異因子2(Periostin)的mRNA表達(dá)情況，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HIF-1α、TGF-β1蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果低氧與常氧下的KFs增殖活力無(wú)明顯差異；STS在常氧和低氧下明顯抑制KFs增殖(P<0.01)，其有劑量依賴性，在低氧條件下STS的起效劑量比常氧下的高。低氧能夠引起HIF-1α的mRNA和蛋白分別增加0.606(P=0.037)、0.950(P=0.002)，VEGF mRNA上調(diào)7.256(P=0.043)，Periostin mRNA上調(diào)6.285(P=0.006)，TGF-β1蛋白增加1.641(P=0.011)，對(duì)Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響。常氧下，200 μmol/L的STS增加HIF-1α和Periostin的mRNA表達(dá)分別為0.750(P=0.015)和8.553(P=0.000)，減少TGF-β1、Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA表達(dá)分別為0.349(P=0.007)、0.320(P=0.006)、0.453(P=0.015)，對(duì)TGF-β1蛋白和VEGF mRNA表達(dá)影響不明顯。低氧48 h，200 μmol/L的STS使HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)分別減少0.548(P=0.016)、0.984(P=0.001)，對(duì)TGF-β1 mRNA和蛋白以及Col Ⅰ、Col Ⅲ、VEGF、Periostin的mRNA表達(dá)影響不明顯。 結(jié)論 常氧和低氧下STS對(duì)KFs的增殖均有抑制作用，并能夠影響促纖維化因子的表達(dá)，可能作為治療瘢痕疙瘩的潛在藥物。

丹參酮ⅡA磺酸鈉； 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞； 低氧； 增殖； 基因表達(dá)

瘢痕疙瘩(keloid)是以瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts，KFs)異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為主要病理特征的皮膚纖維化疾病，常在皮膚損傷后發(fā)生，具有超出原損傷范圍、不能自發(fā)消退、手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)的表現(xiàn)。目前，其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，也無(wú)滿意的治療藥物，嚴(yán)重影響了包括微創(chuàng)手術(shù)在內(nèi)的各種手術(shù)后傷口愈合質(zhì)量，傷口瘢痕疙瘩的形成也給患者帶來(lái)巨大的心理創(chuàng)傷。研究顯示瘢痕組織中存在因血管閉塞等引起的血供不足及缺氧的微環(huán)境[1,2]，可能是引起創(chuàng)傷過(guò)度愈合、皮膚纖維化增生形成瘢痕疙瘩的機(jī)制之一[3]。丹參及其有效成分丹參酮ⅡA在多個(gè)器官(肝、心、肺、腎等)的抗纖維化作用已有報(bào)道[4～7]，研究表明其主要通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原分泌等發(fā)揮作用。丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)是丹參酮ⅡA經(jīng)磺酸化后得到的水溶性藥物，藥效更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)的KFs，并嘗試模擬瘢痕疙瘩體內(nèi)低氧微環(huán)境，觀察常氧和低氧下，STS對(duì)KFs增殖及促纖維化因子的影響，探討STS是否具有抑制瘢痕疙瘩形成的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批文號(hào)IRB00006761-2014173)，在患者知情同意下，取5例瘢痕疙瘩切除術(shù)后廢棄的標(biāo)本，患者術(shù)前均未使用過(guò)類固醇激素、抗腫瘤藥物和放射治療等，男1例，女4例，年齡分別為4、19、30、52、54歲，瘢痕位于耳部3例，胸部2例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗(以色列BioInd公司)，DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)，CCK-8(Cell Counting Kit-8)試劑盒(日本同仁)，低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)抗體(abcam公司)，以上試劑均為市售；引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。細(xì)胞培養(yǎng)箱、自動(dòng)酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國(guó)Thermo公司；DMIL倒置顯微鏡產(chǎn)自德國(guó)Leica公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)產(chǎn)自美國(guó)LI-COR公司；熒光定量PCR儀(IQ5)產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀為BD公司的FACSAria Ⅱ定制系統(tǒng)。

1.2.2 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則，用含有5%青霉素和鏈霉素雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)將標(biāo)本漂洗干凈，再?gòu)氐兹コ龢?biāo)本的表皮和皮下脂肪組織，剪成約0.5 mm×0.5 mm大小的貼壁用組織塊，均勻接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)。5例細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)，采用第3～8代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 STS對(duì)KFs形態(tài)學(xué)的影響 將KFs傳代接種于6孔培養(yǎng)板中，常氧下培養(yǎng)過(guò)夜，加入STS，調(diào)整劑量為0、50、100、200、400、800 μmol/L，再分別置于常氧(21%O2)或低氧(2%O2)下培養(yǎng)48 h，利用倒置顯微鏡直接進(jìn)行觀察。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 按每孔1500個(gè)/100 μl將KFs接種于96孔板，常氧條件下培養(yǎng)過(guò)夜，加入STS，調(diào)整STS劑量為0、50、100、200、400、800 μmol/L，每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)平行孔。分別置于常氧或低氧條件下培養(yǎng)48 h，棄上清，每孔加入100 μl CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度(OD)間接代表細(xì)胞數(shù)量。以常氧STS 0 μmol/L為對(duì)照孔，無(wú)細(xì)胞及STS的等量無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基為空白孔，細(xì)胞增殖活力=[(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)]×100%。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)促纖維化基因表達(dá) 將KFs傳代接種于直徑100 mm培養(yǎng)皿中，常氧條件下培養(yǎng)過(guò)夜，加入不同劑量STS(0、100、200 μmol/L)，再分別置于常氧和低氧下培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。采用Trizol法(天根公司)提取總RNA，微量核苷酸測(cè)定儀測(cè)定濃度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司)反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參基因，常氧下STS 0 μmol/L為對(duì)照組，用2-ΔΔCT法或2-ΔCT(cycle threshold，閾值循環(huán)數(shù))計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔCT=CT目的-CT內(nèi)參，ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-ΔCT對(duì)照組。所用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)HIF-1α、TGF-β1蛋白表達(dá) 組別設(shè)置同mRNA基因檢測(cè)，收集細(xì)胞后提取細(xì)胞總蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定蛋白濃度。按常規(guī)方法進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，電泳上樣量為60 μg，用5% BSA封閉1 h，一抗(TGF-β1、HIF-1α 1∶1000，β-actin 1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST液(Tris-Buffered Saline and Tween 20)洗膜后二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)采集圖像。用Quantiy One圖像分析系統(tǒng)獲得條帶的積分光密度(integral optical density，IOD)。以β-actin為內(nèi)參蛋白，常氧下STS 0 μmol/L為對(duì)照組，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=(IOD實(shí)驗(yàn)組目的/IOD實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參)/(IOD對(duì)照組目的/IOD對(duì)照組內(nèi)參)。

2 結(jié)果

2.1 STS對(duì)KFs形態(tài)學(xué)的影響

見(jiàn)圖1。常氧與低氧條件下培養(yǎng)的KFs細(xì)胞生物形態(tài)學(xué)無(wú)明顯差異。加入STS后，隨著劑量的增加，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、突起變得更細(xì)長(zhǎng)、間隙增寬，部分細(xì)胞體積增大，細(xì)胞輪廓變淡。當(dāng)STS劑量達(dá)到800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞折光性增高，貼壁細(xì)胞稀少，幾乎不生長(zhǎng)。常氧和低氧下STS對(duì)KFs形態(tài)學(xué)的影響鏡下觀察無(wú)明顯差異。

圖1 STS對(duì)KFs干預(yù)48 h后倒置相差顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)變化(×100) A：常氧條件；B：低氧條件；a：STS 0 μmol/L；b：STS 50 μmol/L；c：STS 100 μmol/L；d：STS 200 μmol/L；e：STS 400 μmol/L；f：STS 800 μmol/L

2.2 常氧和低氧下STS對(duì)KFs增殖的影響

見(jiàn)圖2。KFs在常氧和低氧下培養(yǎng)48 h后其細(xì)胞增殖狀況無(wú)顯著差異。常氧下，STS從100至800 μmol/L對(duì)KFs的增殖均有明顯抑制(P<0.01)。低氧下，STS的起效劑量高于常氧下，STS從200至800 μmol/L可見(jiàn)明顯抑制增殖作用(P<0.01)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在常氧和低氧下STS對(duì)KFs作用的劑量選用100及200 μmol/L。

圖2 常氧和低氧下STS干預(yù)48 h后KFs細(xì)胞增殖活力的變化 **與常氧對(duì)照組比較，P<0.01；##與低氧對(duì)照組比較，P<0.01；n=5

2.3 常氧和低氧下STS對(duì)KFs促纖維化因子表達(dá)的影響

2.3.1 STS對(duì)HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)

表2。低氧培養(yǎng)48 h，低氧組HIF-1α相對(duì)常氧組表達(dá)增加，其中mRNA表達(dá)增加0.606(P=0.037)，蛋白表達(dá)增加0.950(P=0.002)。常氧下，STS組HIF-1α表達(dá)相對(duì)常氧組有增加的趨勢(shì)，STS 200 μmol/L時(shí)，mRNA表達(dá)增加0.750(P=0.015)，其他的增加趨勢(shì)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低氧下，STS組HIF-1α的表達(dá)較低氧組則有下降的趨勢(shì)，STS 200 μmol/L時(shí)mRNA表達(dá)降低0.548(P=0.016)，蛋白表達(dá)降低0.984(P=0.001)。

2.3.2 常氧和低氧下STS對(duì)TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。相對(duì)常氧組，低氧下培養(yǎng)48 h低氧組TGF-β1 mRNA表達(dá)下降0.382(P=0.002)，蛋白表達(dá)增加1.641(P=0.011)。常氧下，STS抑制TGF-β1 mRNA表達(dá)，STS 200 μmol/L時(shí)表達(dá)下調(diào)0.349(P=0.007)； TGF-β1蛋白表達(dá)有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著差異(P>0.05)。低氧下，STS對(duì)KFs的TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。

表2 常氧和低氧下STS對(duì)KFs細(xì)胞HIF-1α和TGF-β1表達(dá)的影響

各個(gè)因子的相對(duì)表達(dá)量均是相對(duì)其各自常氧組的表達(dá)量來(lái)表示。與常氧組比較*P<0.05，**P<0.01；與低氧組比較#P<0.01。HIF-1α mRNA的常氧+STS 100 μmol/L、常氧+STS 200 μmol/L、低氧+STS 200 μmol/L組n=4；其余各組n=5

2.3.3 常氧和低氧下STS對(duì)KFs細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)及其比值的影響 低氧培養(yǎng)48 h，與常氧組比較，低氧組Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)及其比值未見(jiàn)顯著變化。常氧下，相對(duì)于常氧組，STS 100、200 μmol/L組的Ⅰ型膠原表達(dá)分別降低0.339(P=0.012)、0.320(P=0.006)，Ⅲ型膠原表達(dá)分別降低0.452(P=0.015)、0.453(P=0.015)；STS對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的抑制未見(jiàn)明顯劑量依賴性。低氧下，相對(duì)于低氧組，STS組的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)。無(wú)論是常氧還是低氧下，各組STS對(duì)KFs細(xì)胞的Ⅰ、Ⅲ型膠原比值均無(wú)明顯影響(P>0.05)(表3)。

表3 在常氧和低氧下STS對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響

COL1A1、COL3A1的mRNA表達(dá)采用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值則采用2-ΔCT進(jìn)行計(jì)算[8]。與常氧組比較*P<0.05，**P<0.01。n=5

2.3.4 常氧和低氧下STS對(duì)KFs細(xì)胞VEGF和Periostin mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)圖3。低氧培養(yǎng)48 h，低氧組相對(duì)常氧組VEGF和Periostin的mRNA表達(dá)分別增加7.256(P=0.043)、6.285(P=0.006)。常氧下，STS 200 μmol/L組相對(duì)常氧組，Periostin mRNA表達(dá)增加8.553(P=0.000)。低氧下，STS 200 μmol/L組相對(duì)低氧組，Periostin表達(dá)減少2.139(P=0.310)，似乎有一定的抑制傾向。其他組STS對(duì)KFs的VEGF和Periostin mRNA表達(dá)未表現(xiàn)出顯著作用(P>0.05)。

圖3 常氧和低氧下STS對(duì)KFs細(xì)胞VEGF和Periostin mRNA表達(dá)的影響。A：VEGF的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，低氧組n=4，其余各組n=5。B：Periostin的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，n=5。與常氧組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討論

瘢痕疙瘩是一種創(chuàng)傷后組織過(guò)度修復(fù)的表現(xiàn)。在研究創(chuàng)傷與瘢痕疙瘩形成的過(guò)程中，學(xué)者們觀察到與瘢痕疙瘩形成相關(guān)的低氧微環(huán)境的存在[9]。研究表明，低氧微環(huán)境與KFs異常增殖及膠原合成、ECM重塑紊亂密切相關(guān)[10,11]。因此，尋找能夠改善瘢痕組織低氧微環(huán)境、抑制KFs異常增殖及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積藥物，對(duì)治療瘢痕疙瘩特別是有可能由低氧微環(huán)境引起的瘢痕疙瘩有著重要的意義。

活血化瘀類中藥丹參及其有效成分具有明確的多種生物活性功能，包括抗氧化、抑制細(xì)胞增殖以及抗炎等，在瘢痕疙瘩等纖維化疾病的治療方面得到越來(lái)越多的關(guān)注[12]。丹參的有效成分主要包括丹參酮和丹酚酸兩大類化合物，本研究所用的STS屬于丹參酮類化合物。丹參酮類化合物以改善血液循環(huán)、抗菌和抗炎[13]作用為主，另外還有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[14]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)缺氧病理微環(huán)境，觀察常氧和低氧下STS對(duì)KFs增殖及促纖維化因子的影響，進(jìn)一步研究丹參酮類化合物在治療瘢痕疙瘩方面可能的作用。

常氧下，左強(qiáng)等[15]觀察到丹參酮ⅡA能夠抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋STS亡。本實(shí)驗(yàn)觀察到，常氧下和低氧下STS對(duì)瘢痕疙瘩細(xì)胞的增殖均具有抑制作用，而且存在劑量依賴性。另外，與常氧比較，低氧下STS抑制KFs增殖的起效劑量增高，同樣劑量的STS對(duì)于KFs增殖抑制作用更小。常氧和低氧下STS對(duì)KFs作用的差異可能和KFs在低氧條件下細(xì)胞的增殖等功能狀況改變有關(guān)。我們以前的研究[16]表明，在適度低氧條件下成纖維細(xì)胞增殖力增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中也觀察到KFs在低氧培養(yǎng)48 h，其HIF-1α和VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，表明低氧環(huán)境確實(shí)影響了細(xì)胞的功能。細(xì)胞的功能狀態(tài)直接影響其對(duì)STS的藥物反應(yīng)性。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)觀察到STS對(duì)KFs在常氧和低氧下的增殖抑制作用存在劑量差異，對(duì)于臨床上STS的可能應(yīng)用需要考慮瘢痕疙瘩病變組織是否存在低氧微環(huán)境酌情適當(dāng)調(diào)整藥物劑量。

在低氧微環(huán)境中，有研究表明KFs細(xì)胞能夠上調(diào)HIF-1α調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，使periostin、TGF-β1、VEGF、COL1、COL3等表達(dá)增加，KFs細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、膠原分泌和Akt磷酸化水平均升高[16,17]，血管增殖[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STS能夠顯著抑制因低氧上調(diào)的HIF-1α表達(dá)，對(duì)受HIF-1α調(diào)控的、同樣可被低氧上調(diào)的Periostin(瘢痕疙瘩過(guò)度增生的重要促進(jìn)因子)也表現(xiàn)出一定的抑制傾向，表明STS可能可以通過(guò)抑制HIF-1α實(shí)現(xiàn)改善低氧微環(huán)境的作用。另外，在常氧下，我們卻觀察到STS能夠促進(jìn)HIF-1α和periostin表達(dá)，對(duì)此，目前還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，需要進(jìn)一步的研究探討。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是目前已知的與瘢痕疙瘩形成最為密切的細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)KFs細(xì)胞增殖和膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的形成，同時(shí)還可抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，從而促進(jìn)ECM的沉積[19]。抑制TGF-β1可以有效的治療病理性瘢痕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常氧下STS能夠抑制TGF-β1表達(dá)，隨著TGF-β1 mRNA的下降，Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA也出現(xiàn)了下調(diào)；說(shuō)明常氧下STS可以下調(diào)TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原的mRNA，從而可能起到抑制瘢痕的作用。相關(guān)研究也有報(bào)道，黃芪和丹參提取物的混合物可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF/Smad信號(hào)通路抑制KFs的增殖、遷移和膠原分泌[20]。低氧培養(yǎng)48 h，我們觀察到KFs的TGF-β1 mRNA出現(xiàn)下調(diào)，而STS對(duì)下調(diào)了的TGF-β1表達(dá)未見(jiàn)顯著影響。有文獻(xiàn)報(bào)道丹參酮的這一藥理作用也并不明顯，這可能是由于低氧刺激KFs的細(xì)胞生物學(xué)功能變化從而對(duì)STS不敏感所致。然而，這需要更多的實(shí)驗(yàn)研究證明。這也提示我們?cè)谟玫⒌人幬镏委燅：鄹泶駮r(shí)需考慮微環(huán)境在發(fā)病機(jī)制中的作用和相應(yīng)的變化，以及這些變化對(duì)藥物的藥理作用的可能影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，STS能夠抑制KFs增殖和促纖維化因子的表達(dá)，其在瘢痕疙瘩的治療方面具有良好的應(yīng)用前景。

致謝：感謝北京大學(xué)第三醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室老師們對(duì)本課題所提供的技術(shù)支持和幫助。

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(修回日期：2015-05-07)

(責(zé)任編輯：王惠群)

Effects of Sodium Tanshinone ⅡA Sulfonate Under Hypoxia on Proliferation of Keloid Fibroblasts and Expression of Pro-Fibrogenic Factors

KangChunfu,ChenBin,QinZelian,etal.

DepartmentofPlasticSurgery,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191,China

Correspondingauthor:QinZelian,E-mail:qinzl@bjmu.edu.cn

Objective To study the effects of sodium tanshinone ⅡA sulfonate (STS) under normoxia and hypoxia on proliferation of keloid fibroblasts (KFs) and expression of pro-fibrogenic factors, and to explore the potential therapeutic role of STS for keloid. Methods A total of 5 cases of KFs were cultured and then divided into different groups. The samples were treated with different doses of STS (0, 50, 100, 200, 400, and 800 μmol/L) for 48 h under normoxia (21% O2) or hypoxia (2% O2). The proliferation activity of KFs was detected with CCK-8 kit and the cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope. After treatment of STS (0, 100, and 200 μmol/L, respectively), real time PCR assay was adopted to measure the mRNA expression of hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α), transforming growth factor β1 (TGF-β1), collagen type Ⅰ (Col Ⅰ), collagen type Ⅲ (Col Ⅲ), vascular endothelial growth factor (VEGF), and periostin (PN). The protein expressions of HIF-1α and TGF-β1 were examined by western blot assay. Results The proliferation activity of KFs was not significantly different between normoxia and hypoxia. The STS inhibited the proliferation of KFs in a dose-dependent manner in normoxia and hypoxia (P<0.05). The minimal effective dose in hypoxia was higher than that in normoxia. Hypoxia for 48 h changed the expressions of pro-fibrogenic factors. The mRNA and protein expressions of HIF-1α were increased by 0.606 (P=0.037) and 0.950 (P=0.002), respectively. The mRNA expression of VEGF was increased by 7.256 (P=0.043). The mRNA expression of periostin was increased by 6.285 (P=0.006). The protein expression of TGF-β1 was increased by 1.641 (P=0.011). However, the STS did not significantly effected on the mRNA expressions of Col Ⅰ and Col Ⅲ. Treated with STS under normoxia for 48 h, the mRNA expressions of HIF-1α and periostin were increased by 0.750 (P=0.015) and 8.553 (P=0.000), respectively. The mRNA expressions of TGF-β1, Col Ⅰ, and Col Ⅲ were decreased by 0.349 (P=0.007), 0.320 (P=0.006), and 0.453 (P=0.015), respectively. There were not significant changes in the expressions of TGF-β1 protein and VEGF mRNA (P>0.05). Treated with STS under hypoxia for 48 h, the mRNA and protein levels of HIF-1α were decreased by 0.548 (P=0.016) and 0.984 (P=0.001), respectively. There were no significant changes in the mRNA levels of TGF-β1, Col Ⅰ, Col Ⅲ, VEGF,and periostin, as well as the protein level of TGF-β1. Conclusions The STS inhibits KFs proliferation in a dose-dependent manner and affects the expressions of pro-fibrogenic factors under both normoxia and hypoxia. The STS could be used as a candidate of therapeutic treatment against keloid.

Sodium tanshinone ⅡA sulfonate; Keloid fibroblast; Hypoxia; Proliferation; Gene expression

教育部博士點(diǎn)博導(dǎo)專項(xiàng)基金資助課題(20130001110095)

R619+.6

A

1009-6604(2015)07-0649-06

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.07.021

2015-04-27)

** 通訊作者，E-mail：qinzl@bjmu.edu.cn

① (北京大學(xué)第三醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

② (北京積水潭醫(yī)院燒傷科，北京 100035)