應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測胃癌組織中Lgr5和CD44的表達

劉元華，　樊祥山，　惲　艷

論著

應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測胃癌組織中Lgr5和CD44的表達

劉元華，樊祥山，惲艷

【摘要】目的研究胃癌組織中Lgr5和CD44的表達水平及其臨床病理意義。方法應(yīng)用組織芯片和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測南京市鼓樓醫(yī)院及江蘇省腫瘤醫(yī)院2005年1月至2008年12月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本273例胃癌組織中的Lgr5和CD44蛋白表達，并應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析Lgr5和CD44的表達水平與胃癌各種臨床病理特征的關(guān)系及兩者相關(guān)性。結(jié)果Lgr5在胃癌組織中表達與腫瘤pTNM分期有關(guān)(P<0.05)，與腫瘤分化程度、浸潤程度、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P>0.05)。CD44在胃癌組織中的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期均無關(guān)(P>0.05)。Lgr5和CD44的表達在胃癌組織中無相關(guān)性(P>0.05)。Logistic回歸分析，Lgr5及CD44高表達、腫瘤分化及pTNM分期等均與胃癌預(yù)后不良有關(guān)。單因素分析，胃癌組織中Lgr5及CD44表達、腫瘤分化程度、pTNM分期、脈管侵犯等均與預(yù)后相關(guān)。多因素分析進一步證實，胃癌組織中Lgr5及CD44表達、腫瘤分化程度及pTNM分期等均與預(yù)后相關(guān)。結(jié)論Lgr5、CD44高表達是胃癌預(yù)后不良的標(biāo)志，可以作為獨立的預(yù)后因子。在胃癌中，檢測Lgr5、CD44的表達可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的有效手段之一。

【關(guān)鍵詞】胃癌；腫瘤干細胞；Lgr5蛋白；CD44蛋白；組織芯片

胃癌(gastric cancer，GC)是最常見的胃腸道腫瘤之一，其死亡率位居癌癥死亡率前列，而且很大一部分患者在確診時就已經(jīng)進入晚期，至今還沒有一種可靠的標(biāo)記物能在早期就篩查出患癌高風(fēng)險人群。近年來一個全新的理論腫瘤干細胞理論，成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點，這個理論認為：在原發(fā)性腫瘤組織中存在著極少量一種細胞亞群，這種細胞亞群具有自我更新、多向分化和無限增殖的潛能，這個亞群就是腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)，腫瘤干細胞被認為是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源[1]。Lgr5是G蛋白耦聯(lián)受體家族中的一員，最近研究結(jié)果顯示，Lgr5可以作為胃癌腫瘤干細胞標(biāo)記物[2]。CD44作為一種粘附分子，可以通過跨膜糖蛋白的方式介導(dǎo)細胞間或細胞與基質(zhì)間的相互作用，在細胞的粘附、血管的形成和腫瘤的浸潤和增殖中發(fā)揮重要作用，CD44也被作為是胃癌的腫瘤干細胞標(biāo)志物[3]。在胃癌中，Lgr5和CD44表達與胃癌的臨床病理因素及預(yù)后的相關(guān)性尚不甚清楚，胃癌組織中Lgr5和CD44表達的相關(guān)性也不明確。本研究將應(yīng)用組織芯片及免疫組化來研究腫瘤干細胞標(biāo)記物L(fēng)gr5和CD44在胃腺癌中的表達，并分析二者與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系以及相關(guān)性，旨在從干細胞相關(guān)標(biāo)志角度研究胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，干細胞相關(guān)標(biāo)志與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為胃癌的臨床診斷提供新線索，為以干細胞標(biāo)志為靶點的靶向治療提供新思路。

1資料與方法

1.1一般資料收集南京市鼓樓醫(yī)院及江蘇省腫瘤醫(yī)院2005年1月至2008年12月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本273例，其中男性182例(66.7%)，女性91例(33.3%)，年齡22~83歲，中位年齡62歲。TNM分期按照2010年第七版AJCC分期，末次隨訪時間為2012年11月30日，其中167例存活，患者隨訪時間3~81個月。所有入組胃癌患者術(shù)前均未進行放療和化療。

1.2主要試劑Lgr5兔抗人單克隆抗體購自Lifespan Biosciences公司；CD44鼠抗人單克隆抗體購自Zymed Laboratories公司。

1.3組織芯片構(gòu)建復(fù)習(xí)所有患者的全部HE切片，確定有代表性的病變部位并在相應(yīng)的蠟塊上做好標(biāo)記。應(yīng)用組織微陣列打孔儀(購自美國Beecher instrument公司)在空白蠟塊打孔，然后在蠟塊的標(biāo)記部位穿刺與孔大小相同的蠟柱，準(zhǔn)確放入空白蠟塊的小孔中，依次按序操作。每個病例重復(fù)取點3次，以獲得較好的代表性。制作完成的組織芯片蠟塊4 μm連續(xù)切片50張，置于-20 ℃儲存。

1.4免疫組化染色測定依照EnVision試劑盒說明書行免疫組化染色。PBS代替一抗作陰性對照。免疫組化結(jié)果由兩位富有經(jīng)驗的高年資病理醫(yī)師通過雙盲法獨立評估。

1.5免疫組化結(jié)果評判根據(jù)腫瘤細胞染色強度進行評分：無色為0；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。每張切片上觀察5個高倍視野(×200)，計數(shù)陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%~25%為1分，26%~50%為2分，51%~75%為3分，76%~100%為4分。按照染色強度評分與陽性細胞百分比評分的乘積決定最終染色結(jié)果，總分為0~12 分：其中0分記為0，即陰性；1~3 分記為1+，即弱陽性(低表達)；4~7 分記為2+， 8~12分記為3+，2+以上為強陽性(高表達)。Lgr5以細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，CD44以細胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性。

1.6統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件包處理。采用χ2檢驗和Fisher’s檢驗及Spearman等級相關(guān)分析進行?；颊叩纳鏀?shù)據(jù)進行Kaplan-Meier法分析，并繪制生存曲線，應(yīng)用log-rank檢驗差異性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Lgr5和CD44在胃癌組織中的表達由于掉片，11例標(biāo)本被剔除，故273例胃癌中有Lgr5檢測結(jié)果的是262例，胃癌組織中Lgr5表達與腫瘤pTNM分期相關(guān)(P<0.05)，而與其他臨床病理因素如性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

由于掉片，35例標(biāo)本被剔除，故273例胃癌中有CD44檢測結(jié)果是238例，胃癌組織中CD44表達與臨床病理因素性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、pTNM分期均無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1　Lgr5和CD44表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2CD44及Lgr5表達在胃癌中的相關(guān)性分析對CD44及Lgr5表達進行Spearman等級相關(guān)分析，結(jié)果表明，273例胃癌標(biāo)本中，CD44及Lgr5表達在胃癌中不存在相關(guān)性(r=-0.012，P=0.861)

2.3胃癌死亡危險因素Logistic回歸分析應(yīng)用Logistic回歸分析胃癌死亡危險因素，結(jié)果表明，胃癌不良預(yù)后(死亡)與腫瘤分化程度、pTNM分期、Lgr5及CD44高表達相關(guān)，而與患者性別及年齡無關(guān)，詳見表2。

2.4胃癌的單因素、多因素生存分析及Kaplan-Meier生存分析各種臨床病理因素、CD44及Lgr5的表達水平與預(yù)后的單因素分析顯示，腫瘤的預(yù)后與分化程度、pTNM分期、脈管侵犯、Lgr5高表達及CD44高表達相關(guān)(P<0.05)。多因素分析顯示，腫瘤預(yù)后與分化程度、pTNM分期、Lgr5高表達及CD44高表達相關(guān)(P<0.05)(見表3)?；颊叩纳鏀?shù)據(jù)進行Kaplan-Meier法分析，log-rank檢驗顯示，Lgr5及CD44的高表達水平組生存期顯著短于中表達水平組及低水平表達組，Lgr5及CD44的中表達水平組生存期顯著短于低水平表達組(均P<0.05)(見圖1、圖2)。

表2　胃癌患者死亡危險因素Logistic回歸分析

表3　胃癌的單因素、多因素生存分析

圖1　胃癌組織Lgr5表達的Kaplan-Meier生存曲線

圖2　胃癌組織CD44表達的Kaplan-Meier生存曲線

3討論

目前腫瘤最新研究觀點認為：在腫瘤中存在少量的腫瘤干細胞，這些腫瘤干細胞具有自我更新無限增殖的能力，促進癌細胞的產(chǎn)生，正是腫瘤干細胞導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，是腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)的最主要原因之一。因此，對這些腫瘤干細胞的早期發(fā)現(xiàn)以及針對其進行的靶向治療可能在癌癥的早期診斷及治療中具有重要的作用。Lgr5是Wnt信號途徑的靶基因，屬于7次螺旋跨膜糖蛋白激素受體類，Lgr5被認為是小腸[4]、大腸[4]及胃[5]等組織器官的干細胞標(biāo)志，免疫組化證實，在肝癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、卵巢癌[7]、基底細胞癌[8]及食管癌[9]等惡性腫瘤中高表達，并且與腫瘤發(fā)生、進展及預(yù)后相關(guān)。Takahashi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5mRNA高表達者更易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移，TNM分期更晚。本研究應(yīng)用胃癌組織芯片技術(shù)進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Lgr5表達與腫瘤pTNM分期相關(guān)(P<0.05)，pTNM分期晚者Lgr5表達水平高，而與其他臨床病理因素如腫瘤分化程度、浸潤深度、脈管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)。Logistic回歸分析胃癌危險因素表明，胃癌腫瘤分化程度、pTNM分期、Lgr5高表達均與不良預(yù)后(死亡)相關(guān)(P<0.05)。各種臨床病理因素及Lgr5的表達水平與單因素分析顯示，腫瘤分化程度、pTNM分期、脈管侵犯及Lgr5高表達均與預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。多因素分析顯示，腫瘤分化程度、pTNM分期及Lgr5高表達均與預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。將患者的生存數(shù)據(jù)進行Kaplan-Meier法分析，log-rank檢驗顯示，Lgr5的高表達水平組生存期顯著短于中表達水平組及低水平表達組，Lgr5的中表達水平組生存期顯著短于低水平表達組(P<0.05)。這些結(jié)果表明，干細胞標(biāo)志Lgr5高表達是胃癌預(yù)后不良的標(biāo)志，可以作為獨立的預(yù)后因子。在胃癌中，檢測Lgr5的表達可以作為判斷胃癌患者預(yù)后的有效手段之一。

CD44分子是一種細胞黏附分子，其功能是介導(dǎo)淋巴細胞的歸巢、淋巴細胞向炎癥部位和黏膜相關(guān)淋巴組織歸位、粘附細胞外基質(zhì)等，CD44被認為是一種腫瘤干細胞標(biāo)志[11]。CD44的高表達是胃癌的不良預(yù)后因子[12]。本研究應(yīng)用胃癌組織芯片進行免疫組化檢測CD44的表達，胃癌組織中CD44表達與臨床病理因素如性別、年齡、腫瘤分化程度、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、pTNM分期均無相關(guān)性(P>0.05)。Logistic回歸分析胃癌危險因素，結(jié)果表明，胃癌腫瘤分化程度、pTNM分期及CD44高表達均與不良預(yù)后(死亡)相關(guān)(P<0.05)。各種臨床病理因素及CD44的表達水平與預(yù)后的單因素分析顯示，腫瘤分化程度、pTNM分期、脈管侵犯及CD44高表達均與預(yù)后相關(guān)(P<0.05)。多因素分析顯示，腫瘤分化程度、pTNM分期及CD44高表達均與預(yù)后相關(guān)(P< 0.05)。患者的生存數(shù)據(jù)進行Kaplan-Meier法分析，log-rank檢驗顯示，CD44的高表達水平組生存期顯著短于中表達水平組及低水平表達組，CD44的中表達水平組生存期顯著短于低水平表達組(P<0.05)。這些結(jié)果表明，干細胞標(biāo)志CD44高表達是胃癌預(yù)后不良的標(biāo)志，可以作為獨立的預(yù)后因子，這與先前Doventas等[12]的報道一致。

本研究結(jié)果表明，Lgr5和CD44的表達無相關(guān)性(P<0.05)，我們推測，這可能表明Lgr5和CD44在胃癌腫瘤干細胞中并不同時表達，它們可能是胃癌腫瘤干細胞不同發(fā)育階段的標(biāo)志。本研究表明Lgr5及CD44的高表達為胃癌的不良預(yù)后因子，Lgr5及CD44的高表達可能成為胃癌患者術(shù)后進行輔助化療的一個重要指標(biāo)。目前對于Lgr5或CD44參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機制還尚不明確，但胃癌中LGR5與CD44的高表達普遍存在，且與不良預(yù)后相關(guān)。深入研究Lgr5與CD44的功能以及它們的調(diào)節(jié)機制，將可能更好地對腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移做出預(yù)測，更好地指導(dǎo)臨床治療，有助于開發(fā)以胃癌腫瘤干細胞為靶點的腫瘤治療新方法。

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Detection of Lgr5 and CD44 expression in gastric cancer using tissue microarraysLIUYuanhua1,FANXiangshan2,YUNYan3(1.DepartmentofInternalMedicine,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China；2.DepartmentofPathology,NanjingDrumTowerHospital,Nanjing210009,China；3.Maternalandchildhealthfamilyplanningservicecenter,Wujing,Changzhou213159，China)

Correspondingauthor:YUNYan,E-mail：shiningliu0108@126.com

Abstract：ObjectiveTo study the expression levels of Lgr5 and CD44 and the clinicopathological significances in gastric cancer tissue.MethodsTissue microarray and immunohistochemical staining was used to detect the expression of Lgr5 and CD44 in 273 cases of patients who had undergone gastrectomy for gastric adenocarcinoma. The correlation between Lgr5 and CD44 expression as well as the clinicopathological characteristics were analyzed using statistical method.ResultsLgr5 expression was associated with advanced pathological TNM stage(P=0.025). Lgr5 expression was not associated with poorly differentiated histology, invasion depth, lymph node metastasis and lymphatic invasion(P>0.05). CD44 expression was not correlated with clinicopathological features(P>0.05). Lgr5 expression was not correlated with CD44 expression(P>0.05). High Lgr5 expression，high CD44 expression，poorly differentiated histology and advanced pathological TNM stage were strong predictors of death in logistic regression analysis. Both Lgr5 expression and CD44 expression were associated significantly with poor overall survival in univariate analysis(P<0.05). Furthermore, on the basis multivariate analysis, Lgr5 and CD44 were independent markers of poor prognosis, along with pathological TNM stage and histologic grade(P<0.05).ConclusionsLgr5 expression and CD44 expression might be useful markers of poor prognosis in gastric cancer.

Keywords：Gastric cancer；Cancer stem cells;Lgr5;CD44;Tissue microarrays

[收稿日期：2015-09-17][本文編輯：李慶]

文章編號：1674-4136(2015)06-0341-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.06.001

通訊作者：惲艷，女，研究方向：腫瘤病理學(xué)，E-mail：shiningliu0108@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No. 81101815)
作者單位： 210009江蘇南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科(劉元華)；210008江蘇南京，鼓樓醫(yī)院病理科(樊祥山)；213159江蘇常州，常州武進區(qū)婦幼保健計劃生育服務(wù)中心(惲艷)
第一作者： 劉元華，男，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤內(nèi)科治療，E-mail：yuanhualiu02@hotmail.com